侵染海南雪茄煙的中國黃花稔曲葉病毒侵染性克隆的構建

李萌，夏長劍，楊金廣，王天玉，呂洪坤，吳會杰

1 鄭州輕工業大學煙草科學與工程學院，河南鄭州高新區科學大道136號 450000；

2 中國煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所，海南省海口市紅城湖路22號 571100；

3 中國農業科學院煙草研究所，山東青島嶗山區科苑經四路11號 266101；

4 中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州未來路最南端 450009

中國黃花稔曲葉病毒（Sida yellow mosaic China virus，SiYMCNV）于2005年在海南儋州表現黃化、花葉癥狀的雜草黃花稔（Sida acuta）上分離并命名[1]。SiYMCNV屬雙生病毒科（Geminiviridae）金黃色花葉病毒屬（Begomovirus），其病毒基因組由DNA-A和伴隨的衛星DNA-β構成[1]。除黃花稔外，該病毒還可侵染雜草勝紅薊 （Ageratum conyzoides）[2]。由于SiYMCNV僅侵染雜草，自2006年以后，未發現該病毒的研究報道。

2018年4月課題組在海南儋州雪茄煙栽培基地發現一些煙株呈現矮化、曲葉、脈突等典型的曲葉病毒病癥狀（圖1），病葉樣品中擴增得到的DNA-A和DNA-β全長與Xiong等[1]2005年報道的SiYMCNV的DNA-A和DNA-β的序列相似度分別為99%和93%，表明煙草也是SiYMCNV的自然寄主[3]。SiYMCNV曲葉病毒病在海南儋州雪茄煙上的發病率約為1%～5%，發病植株完全喪失經濟價值，造成絕收。因此，本文以侵染海南雪茄煙的SiYMCNV分離物為材料構建了SiYMCNV可高效侵染煙草的侵染性克隆，為分析該病毒對煙草的致病性及進一步開展病原-媒介生物互作、煙草抗病性鑒定等研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

PCR 儀（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；MiniBIS Pro凝膠成像系統（以色列DNR公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒（洛陽吉恩特生物科技有限公司）；植物表達載體pCAMBIA1300（中國農業科學院鄭州果樹研究所瓜類病害課題組保存）；GV3101農桿菌（中國農業科學院鄭州果樹研究所瓜類病害課題組保存）；高保真PCR酶（南京諾唯贊生物科技有限公司）；引物（上海生工生物工程有限公司）。

病葉于2018年4月采自海南儋州海口雪茄研究所試驗田，染病植株顯著矮化、葉片扭曲，脈突明顯（圖1）；接種煙草品種為雪茄煙H382。

1.2 實驗方法和條件

1.2.1 DNA提取

稱取20 mg病葉樣品放入1.5 mL離心管中，應用玻璃研磨棒在離心管內將病葉研磨成均勻漿液，按照DNA提取試劑盒說明書提取病毒基因組DNA。

1.2.2 SiYMCNV DNA-A侵染性克隆構建

以感染病毒的雪茄煙總基因組DNA為模板，應用引物 A-0.5-PstI-F 和 A-XbaI-R（表1）擴增 0.5倍的DNA-A全長序列，回收的擴增產物與經Pst1和XbaI酶切的載體pCAMBIA1300用infusion酶連接，通過雙酶切和測序篩選pCAMBIA1300-0.5A陽性克隆；以感染病毒的雪茄煙總基因組DNA為模板，應用引物A1-XbaI-F和A-XbaI-R（表1）擴增 DNA-A全長，回收的擴增產物與經XbaI酶切的pCAMBIA1300-0.5A載體用infusion酶連接，獲得含有1.5倍串聯重復DNA-A侵染性克隆pCAMBIA1300-1.5A。

圖1 海南田間感染中國黃花稔曲葉病毒植株癥狀Fig.1 Tobacco plant infected by Sida yellow mosaic China virus in the field in Hainan province

表1 構建侵染性克隆和接種植物DNA-A和DNA-β檢測所用引物Tab.1 Primers for construction of infectious clones and for detection of DNA-A and DNA-β in agro-inoculated host plants

1.2.3 SiYMCNV DNA-β 侵染性克隆構建

以感染病毒的雪茄煙總基因組DNA為模板，應用引物β-PstI-F和β-BamH I-R擴增DNA-β 全長序列，回收的擴增產物與經Pst I和BamH I酶切的載體pCAMBIA1300用infusion酶連接，通過雙酶切和測序篩選pCAMBIA1300-β陽性克隆；以感染病毒的雪茄煙總基因組DNA為模板，應用引物 β-BamH I-F和β-BamH I-R（表1）擴增DNA-β全長，回收擴增產物與經BamH I酶切的pCAMBIA1300-β載體用infusion酶連接，獲得含有2倍串聯重復DNA-β全長侵染性克隆pCAMBIA1300-2β。

1.2.4 轉化農桿菌

采用液氮凍融法分別將經雙酶切和測序篩選測序確認的pCAMBIA1300-1.5A和pCAMBIA1300-2β轉化農桿菌GV3101，篩選陽性克隆獲得攜帶1.5倍串聯重復DNA-A的農桿菌GV3101-A和2倍串聯重復DNA-β 全長的農桿菌 GV3101-β。

1.2.5 農桿菌侵染煙草

分別將 GV3101-A 和 GV3101-β 接種于 50 mL LB液體培養基在28℃培養24 h，4000 rpm離心后將菌液在 50 mL 懸浮液（10 mM MgCl2，10 mM 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸，200 μM乙酰丁香酮）中重懸浮。將重懸浮后的GV3101-A和 GV3101-β以1：1比例混和，用1 mL無菌注射器將該混合菌液注射本氏煙和雪茄煙幼苗葉片（各10株）。以接種含空載體pCAMBIA1300農桿菌的本氏煙和雪茄煙作為對照，單獨接種GV3101-A本氏煙和雪茄煙幼苗各5株。接種煙苗在28℃、光周期14 h:10 h、相對濕度65%人工氣候箱生長2周后觀察植物發病情況。應用PCR檢測農桿菌接種植株DNA-A和DNA-β（表1）。

2 結果

2.1 SiYMCNV DNA-A侵染性克隆構建

重組質粒pCAMBIA1300-1.5A經PstI酶和XbaI酶切后形成3個片段，大小分別與質粒pCAMBIA1300、1 倍 DNA-A（2751 bp）和0.5倍DNA-A（1471 bp）一致（圖2）。測序結果與SiYMCNV DNA-A 一致。

圖2 Pst I和 Xba I酶切重組質粒 pCAMBIA1300-1.5AFig.2 pCAMBIA1300-1.5A digested by Pst I and Xba I

2.2 SiYMCNV DNA-β侵染性克隆構建

重組質粒pCAMBIA1300-2β 經PstI酶和BamH I酶切后形成2個片段，大小分別與質粒pCAMBIA1300和1倍DNA-β（1352 bp）一致（圖3）。測序結果與SiYMCNV DNA-β一致。

圖3 Pst I和 BamH I酶切重組質粒 pCAMBIA1300-2βFig.3 pCAMBIA1300-1.5A digested by Pst I and BamH I

2.3 農桿菌侵染煙草

圖4 SiYMCNV DNA-A或DNA-A和DNA-β混合侵染本氏煙（A）和雪茄煙（B）癥狀Fig.4 Symptoms induced by SiYMCNV DNA-A or by co-infection of DNA-A and DNA-β in Nicotiana benthamiana（A）and N.tabacum cv.H382（B）two weeks after agro-inoculation

注射GV3101-A和GV3101-β混合菌液的本氏煙心葉嚴重畸形，葉片向下卷曲（圖4），發病率為100%。注射GV3101-A 的植株與對照植株葉片形態正常，未顯示癥狀。與本氏煙試驗結果類似，僅接種GV3101-A的雪茄煙植株葉片形態與對照差異不明顯，GV3101-A和GV3101-β混合接種雪茄煙植株心葉嚴重畸形、葉片向下卷曲，發病率為100%。結果表明SiYMCNV DNA-A侵染性克隆不能導致本氏煙和雪茄煙產生癥狀，而DNA-A和DNA-β混合侵染可導致本氏煙和雪茄煙產生與田間自然侵染植株類似的曲葉癥狀。GV3101-A接種煙草均可檢測到DNA-A特異性片段（728 bp），GV3101-A和GV3101-β混合接種煙草均可檢測到DNA-β特異性片段（808 bp）（圖5）。

圖5 SiYMCNV DNA-A或DNA-A和DNA-β混合侵染本氏煙（A）和雪茄煙（B）PCR檢測驗證Fig.5 Confirmation of DNA-A infection or co-infection of DNA-A and DNA-β in agro-inoculated Nicotiana benthamiana（A）and N.tabacum cv.H382（B）by PCR

3 討論

與煙草曲葉病毒病重要病原中國番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)）類似，SiYMCNV DNA-A 單獨侵染不能導致寄主植物表現癥狀，必須和DNA-β共同侵染才能導致煙草表現癥狀，DNA-β編碼的致病因子βC1蛋白與寄主植物相關基因的互作可能是發病植株葉片畸形的重要機制[4]。

煙粉虱傳播的曲葉病毒病是我國福建、云南、廣西等南方煙區重要的煙草病害[5-7]，海南由于以往煙草栽培面積較少，雙生病毒病主要報道在黃花稔[1]、勝紅薊[2]等雜草及甜瓜[8]上發生危害。海南是我國為數不多的適宜雪茄煙栽培的地區之一，其充沛的水熱條件為雙生病毒病及其媒介昆蟲煙粉虱的發生提供了適宜的生存及發生擴散條件，隨著海南雪茄煙種植面積的增加，曲葉病毒病將成為威脅海南雪茄煙產業發展的重要病害。本研究成功構建了侵染海南雪茄煙的中國黃花稔曲葉病毒DNA-A及其伴隨的DNA-β侵染性克隆，DNA-A和DNA-β侵染性克隆可通過農桿菌葉片注射高效侵染本氏煙和栽培雪茄煙H382。DNA-A和DNA-β復合侵染煙草表現典型的曲葉癥狀，這進一步證實了中國黃花稔曲葉病毒是海南儋州雪茄煙曲葉病毒病的病原。SiYMCNV侵染性克隆的構建為進一步開展病毒致病機理和病原-媒介昆蟲-寄主互作等研究奠定了堅實基礎，也為快速篩選、鑒定抗SiYMCNV煙草種質資源提供了簡單、高效的技術手段。