發酵條件對雪茄芯葉TSNAs及其前體物含量變化的影響

李晶晶，史宏志，楊興有，周駿，白若石，秦艷青，陽葦麗

1 河南農業大學國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業煙草栽培重點實驗室/煙草農業減害研究中心，鄭州市金水區文化路95號 450002；

2 上海煙草集團北京卷煙廠，北京市通州區萬盛南街99號 100024；

3 四川省煙草公司，成都市高新區世紀城路936號 600041；

4 四川省煙草公司達州市公司，達州市達川區七里溝 635000

近年來，由于國際控煙的影響和國內消費升級的提速，具有香氣醇厚豐滿、滿足感強、有害成分含量低等特點的雪茄煙異軍突起，為廣大消費者所接受，具有良好的市場發展前景[1]。雪茄煙由茄衣、茄套和茄芯三部分組成[2]，其中茄芯是雪茄煙的核心組分，對雪茄口味的貢獻率可達65%～70%[3]，決定了雪茄煙吸食過程中的香味風格和整體層次[4]。目前，我國主要的雪茄芯葉產區有四川德陽、達州、海南儋州、湖北來鳳[5]。發酵是雪茄煙葉特有的初加工工藝，調制后的新煙需經過3～5周的高溫發酵和18～36個月的醇化來改善煙葉品質[6]。但同時發酵也是煙葉中一類重要有害物質煙草特有亞硝胺（TSNAs）產生和積累的重要時期，初步分析表明，發酵后雪茄煙葉的TSNAs含量比發酵前的煙葉大幅升高[7-8]。關于TSNAs的形成規律和機理，在其他類型煙草中已有較為系統的研究，主要是煙葉調制和貯藏過程中生物堿類物質與亞硝基反應生成的復合物[9-10,11,12]。在雪茄煙發酵過程中，發酵溫度、濕度是影響煙葉質量變化的關鍵因素，同時也會對煙草特有亞硝胺的形成產生互作影響，但目前該方面研究較為欠缺。本研究通過在人工控制條件下設置不同發酵溫度與濕度互作試驗，分別在發酵前后取樣，探究環境溫度和濕度對煙葉TSNAs形成的影響，以明確不同因子對雪茄芯葉發酵過程中TSNAs形成的貢獻，為抑制發酵過程中TSNAs的形成與積累提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為傳統雪茄芯葉什煙1號。供試煙葉為四川省煙草公司提供的2017年調制后質量均勻一致的上一等級煙葉。

1.2 試驗設計

試驗地點位于河南農業大學煙草學院煙草栽培實驗室，試驗設置發酵溫度和發酵濕度2個因素，發酵溫度設置39℃、42℃、45℃和48℃ 4個水平，發酵濕度設置70%、80%和90% 3個水平，共12個處理，每個處理重復三次。

取樣：自發酵之日開始取樣，每隔4天取樣一次，至20 d后結束發酵取完發酵后樣品為止。取得的樣品冷凍干燥后磨碎過孔徑0.25 mm的篩，留取混合樣品測定TSNAs及其前體物生物堿和硝酸鹽含量。

1.3 樣品測定方法

TSNAs含量由上海煙草集團北京卷煙廠進行檢測。測定方法為在線SPE-液相色譜質譜聯用（SPELC-MS/MS）法（SPE-LC: Spark Holland,Symbiosis Pico）；（MS/MS: AB Sciex triple quad 5500）[13]。

生物堿測定參照Jack和Bush[14]的方法。

硝酸鹽含量測定采用戴亞和方力[15]的方法。

1.4 數據分析

試驗數據用 Excel 2010，SPSS 22.0 與 Origin 8.0進行統計分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 煙葉發酵前后4種TSNA及其總量的變化

2.1.1 發酵條件對煙葉4種TSNA含量的影響

圖1 不同發酵條件下煙葉4種TSNA含量變化Fig.1 Changes of 4 TSNA contents in tobacco leaves under different fermentation conditions

由圖1和表1可知，溫度相同時，4種TSNA含量隨環境濕度的增加顯著降低；同一濕度條件下，發酵后煙葉4種TSNA含量在39℃～42℃變化不大，42℃之后隨溫度的升高逐漸增加；在48℃-RH 70%條件下，NNN、NNK、NAB、NAT含量分別達到最大值2237.24 ng/g、155.66 ng/g、109.61 ng/g、2737.74 ng/g。相關分析結果表明，發酵過程中環境濕度與NNN、NNK、NAB、NAT的含量存在顯著的負相關關系，貢獻率分別為38.10%、70.31%、48.39%和48.79%，其中對NAT的影響達到極顯著水平。溫度主要影響了NNN和NNK的積累，對其含量的貢獻率達37.08%和48.48%。二者的交互作用對四種TSNA的影響較小。在此基礎上進行逐步回歸分析（表2），結果顯示在本試驗條件下，發酵過程中4種TSNA含量變化的91.01% ～ 99.03%可由發酵溫度和濕度共同揭示。

2.1.2 發酵條件對煙葉TSNAs總量的影響

由圖1-E可以看出，同一濕度條件下，各處理煙葉的TSNAs含量隨溫度的增加逐漸升高，而同一溫度條件下則隨著濕度的增加呈下降趨勢，此外，低于42℃條件下，TSNAs的含量變化比較緩慢，溫度超過42℃之后，隨溫度的升高煙葉TSNAs含量顯著增加，且增長幅度隨濕度降低而升高。對各處理煙葉的TSNAs含量進行相關分析（表1），結果顯示影響煙葉TSNAs含量的主要因素是發酵濕度，貢獻率為57.01%，其次是溫度，貢獻率28.33%，二者的交互作用僅為 14.66%。回歸方程 m=3461.67+315.28 t -1491.80 h +186.08 t2+392.20 h2-395.71 t*h（R2=0.9799），說明本試驗條件下，發酵過程中TSNAs含量變化有97.99%歸因于溫濕度的作用。

表1 不同發酵條件煙葉TSNAs含量的相關系數及差異性分析Tab.1 Correlation coefficient and difference analysis of TSNAs content in tobacco leaves under different fermentation conditions

表2 不同發酵條件煙葉TSNAs含量的變化趨勢Tab.2 Variation of TSNAs content in tobacco leaves under different fermentation conditions

2.2 發酵條件對煙葉4種TSNA及其總量的變化量

不同發酵條件下各處理煙葉4種TSNA及其總量均大幅增加（表3），且各處理間差異顯著。濕度相同時，隨溫度增加，煙葉4種TSNA及總TSNAs增加量顯著上升，同一溫度下隨濕度增加則表現為相反的變化趨勢。總TSNAs含量在48 ℃-RH 70%時增加量最高，為 3913.46 ng/g，增幅294.96%，42 ℃ -RH 90%時最低，為182.82 ng/g，增幅13.78%，其余處理增幅多集中在40% ～100%。48℃-RH 70%條件下發酵的煙葉4種TSNA增加量最大，增幅在143.70% ～464.42%之間，其中NNN增幅最大，NNK增幅最小。變化幅度最低的處理是42℃-RH 90%，此條件下煙葉增幅不超過20%。

表3 煙葉發酵前后TSNAs變化量的方差分析Tab.3 Analysis of variance of TSNAs variation quantitybefore and after tobacco fermentation

表4 不同溫濕度條件發酵后煙葉生物堿和硝酸鹽含量Tab.4 Content of alkaloids and nitrate in tobacco leaves during the fermentation process under different temperature and humidity conditions %

2.3 不同溫濕度條件對生物堿和硝酸鹽含量的影響

表4顯示了不同溫濕度條件發酵后煙葉TSNAs的前體物生物堿和硝酸鹽的含量。由表可知，發酵后煙葉中的煙堿及生物堿總量隨溫度的增加先降低后升高，隨濕度的增加逐漸上升；硝酸鹽含量與TSNAs的變化規律相反，均表現為同一濕度條件下隨溫度的增加逐漸降低，而同一溫度條件下隨著濕度的增加呈上升趨勢，對各處理煙葉的生物堿總量和硝酸鹽含量進行方差分析，除假木賊堿外，各處理差異均達到極顯著水平，且發酵溫度、濕度及其交互作用均對硝酸鹽含量的影響最大，其次是生物堿總量。

表5 不同溫濕度條件發酵后煙葉生物堿和硝酸鹽含量方差分析表Tab.5 Variance analysis of alkaloid and nitrate contents in tobacco leaves fermented under different temperature and humidity conditions

3 討論與結論

發酵是雪茄煙葉獨特的調制后加工環節，也是雪茄煙TSNAs形成不容忽視的時期。本試驗研究結果表明，發酵后煙葉TSNAs含量顯著增加，其前體物生物堿和硝酸鹽類物質顯著減少，且隨發酵濕度的增加，煙葉TSNAs的增加量持續下降，各處理之間的差異達到極顯著水平，這與前人的研究結果一致[16]。相關分析等結果顯示，發酵濕度對煙葉TSNAs含量的影響最大，貢獻率達57.01%，結合TSNAs前體物生物堿和硝酸鹽含量的變化趨勢，推測可能是由于高濕環境下，煙葉中的硝態氮為水溶態而相對穩定，不易生成揮發性亞硝酸鹽或NO等氣態氮氧化物，與生物堿反應產生的TSNAs含量隨之減少。

基于雪茄煙堆垛發酵過程中容易產生高溫的情況，本文選取39 ～ 48℃溫度段進行試驗。研究結果表明，在3種環境濕度條件下，煙葉4種TSNAs及其總量均與發酵溫度呈正相關，隨著發酵溫度的升高顯著增加，這與SHI等[17]的研究結果一致。當溫度低于42℃時，煙葉TSNAs含量積累緩慢，溫度超過42℃后，煙葉TSNAs含量顯著增加，這可能是由于高溫促進硝酸鹽類物質發生亞硝化反應，進而與生物堿反應造成TSNAs累積，也可能是因為在高溫條件下促進了硝態氮向氣態氮氧化物的形成。這也是我們下一步的研究重點。根據本試驗的研究結果，在溫度低于45℃、濕度高于80%條件下發酵后煙葉TSNAs增加量較小，因此，適當降低發酵溫度或增加發酵濕度是抑制發酵過程中TSNAs產生和積累的有效手段。