β3GnT8基因對肺腺癌A549細胞黏附、遷移、侵襲的影響

行書麗 董永書 (河南醫學高等?？茖W校， 河南 鄭州 450000； 河南省中醫藥研究院)

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤，發病率逐年上升，現已成為死亡率最高的惡性腫瘤之一。早期診斷并阻止其侵襲轉移是目前研究的熱點。腫瘤細胞的糖蛋白糖鏈結構異常是惡性轉化和轉移的普遍特征，故細胞表面的糖鏈結構對腫瘤細胞黏附、遷移、侵襲很重要。β1,3-N乙酰氨基葡萄糖基轉移酶Ⅷ(β3GnT8) 是從人肺cDNA文庫中克隆到的糖基轉移酶家族中的一個新成員〔1〕，該基因在多種腫瘤細胞株中β3GnT8都有不同程度表達，且發現它與惡性腫瘤的浸潤轉移密切相關〔2,3〕。目前該基因對肺癌細胞的浸潤轉移報道較少，本文將β3GnT8的反義表達載體轉染肺腺癌A549細胞，特異性地抑制β3GnT8基因在A549細胞中的表達，來探討β3GnT8對A549細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肺腺癌A549細胞購自中國科學院上海生命科學院細胞庫；DMEM、胎牛血清購自Gibco公司；Trizol購自Ambion公司；引物由北京擎科生物技術有限公司合成；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測試劑盒購自Vazyme公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；兔多抗GAPDH購自杭州賢至生物有限公司；CD147一抗購自Boster公司，基質金屬蛋白酶(MMP)-2一抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司產品；電化學發光(ECL)底物液購自Thermo旗下Nun公司；顯影定影試劑盒購自天津市漢中攝影材料廠。

1.2方法

1.2.1A549細胞培養及傳代 將在液氮中保存的A549細胞取出復蘇，于37℃、 5%CO2飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的完全培養基培養細胞，待細胞的密度達到80%左右時，用0.25%胰酶消化細胞，待細胞相互分離變圓即消化完成，快速棄去胰酶，加入完全培養基，吹打細胞，制成單細胞懸液，按1∶4的比例傳代擴大培養。

1.2.2細胞轉染 將對數培養期的細胞接種至六孔板，當細胞覆蓋達到80%，將β3GnT8真核反義重組載體pEGFP-C1-β3GnT8-AntiSense及空載體 pEGFP-C1通過Lipofectamine2000脂質體介導分別轉染A549細胞。轉染48 h檢測各項指標。將轉染反義表達載體的細胞命名為A549-AS組，轉染空載體的細胞命名為A549-0組，未轉染的A549細胞即為A549組。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測β3GnT8 mRNA的表達 收集3組細胞(A549組、A549-0組及A549-AS組)，用Trizol法提取RNA，于空氣中干燥RNA沉淀8 min，將沉淀溶于20 μl DEPC水中。溶解后的RNA取2 μl用分光光度法測定OD260和OD280，計算RNA的純度和濃度。OD260/OD28比值在1.8～2.0滿足實驗要求。將RNA 逆轉錄成cDNA作為PCR反應的模板。

將cDNA8倍稀釋，構建20 μl的反應體系，以GAPDH作為內參，進行實時熒光定量反應。β3GnT8上游引物為5′-GCTGCCCTTTGCTTACTG-3′，下游引物為5′-GCCCTGGTTCTGACTTGA-3′。最終數據以2-△△Ct進行分析。

1.2.4Western印跡檢測β3GnT8、CD147、MMP2蛋白水平的表達 3組細胞用6孔細胞板培養，吸掉培養上清后用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞3次，每孔加入100 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液，冰上裂解30 min，搖動細胞板使細胞充分裂解，收集至EP管中離心，收集上清，蛋白定量、變性后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，用含5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h,用封閉液稀釋相應的一抗,使聚偏氟乙烯(PVDF)膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育2 h，采用電化學發光，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。用Band Scan分析膠片灰度值。

1.2.5劃痕實驗檢測β3GnT8對細胞遷移能力的影響 取對數生長期的3組細胞(A549、A549-0及A549-AS)，細胞密度為5×105個/ml接種于6孔板，37℃、5%CO2飽和濕度條件培養過夜。待細胞融合鋪滿6孔板底部，用槍頭劃痕，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，同時拍取0 h照片，放入37℃ 5%CO2培養箱培養，24 h拍照，在劃痕處拍照記錄遷移結果。細胞遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度) /0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次。

1.2.6細胞黏附能力檢測 將纖維連接蛋白使用超純水配成1 mg/ml母液，10倍稀釋成100 μg/ml，96孔板每孔加入100 μl稀釋好的纖維連接蛋白溶液，封口膜封口后，冰箱4℃包被過夜，吸出纖維連接蛋白包被液，PBS清洗2次備用。取處于對數生長期的A549細胞，分別調整3組細胞濃度為5×105個/ml，加至包被好的細胞培養板，低速離心培養板2 min，使細胞沉降于培養板底部，37℃、5%CO2培養箱中培養30 min，吸棄未黏附的細胞，用PBS 洗2次，多設置1組正常細胞作為總細胞組，該組不吸棄細胞。每孔加100 μl培養基，取1個高倍鏡(×20)視野拍照。每孔加入10 μl四甲基偶氮唑藍(MTT)，酶標儀測定各孔吸光值OD568。黏附百分比=各組吸光值/總細胞組吸光值×100%。實驗重復3次。

1.2.7穿膜實驗 用無血清DMEM培養基稀釋各組細胞濃度至2×104個/ml，備用。用無血清培養基稀釋Matrigel至終濃度1 mg/ml，在Transwell小室上室底部加入100 μl Matrigel，37℃溫育4 h使其干成膠狀，在24孔板中加入4℃預冷過的含10%胎牛血清的DMEM培養基，并放入Transwell小室，在Transwell上室分別接入200 μl各組細胞懸液，37℃，5% CO2培養箱培養24 h，取出Transwell小室，用PBS小心清洗小室1遍，用棉簽擦去上室的細胞，用70%冰乙醇溶液固定細胞1 h，用0.5%結晶紫染液染色，置于顯微鏡下計數穿膜細胞，以穿膜細胞數表示細胞的侵襲能力。實驗重復3次。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗、非參數檢驗。

2 結 果

2.1轉染后3組細胞β3GnT8 mRNA表達水平比較 A549-AS組β3GnT8 mRNA表達水平(0.316±0.048)顯著低于A549組(1.000±0.000)和A549-0組(0.909±0.037，均P<0.05)。

2.2Western印跡檢測β3GnT8蛋白表達水平比較 A549-AS組β3GnT8的蛋白表達水平顯著低于A549組和A549-0組(均P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測β3GnT8蛋白

表1 3組β3GnT8、CD147、MMP-2蛋白相對表達量

2.3β3GnT8對A549細胞遷移能力的影響 A549-AS組細胞遷移率〔(38.47±3.88)%〕顯著低于A549組〔(66.32±4.17)%〕和A549-0組〔(63.28±3.98)%，均P<0.05〕。

2.4β3GnT8對A549細胞黏附和侵襲能力的影響 A549-AS組對纖維連接蛋白的黏附百分比及侵襲細胞數目顯著低于A549組和A549-0組(均P<0.05)。見表2。

表2 β3GnT8對細胞黏附及侵襲的影響

2.5β3GnT8對MMP-2、CD147表達的影響 A549-AS組CD147、MMP-2水平顯著低于A549組和A549-0組(均P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測β3GnT8對MMP-2、CD147蛋白表達的影響

3 討 論

糖基轉移酶可催化活性糖轉移到不同的受體分子如脂質、蛋白質，形成糖脂、糖蛋白。細胞癌變過程中常伴有糖鏈結構改變,糖鏈結構改變主要反映在細胞表面糖復合物上,也可反映在分泌的糖復合物中。糖基轉移酶的表達異常可能會引起糖鏈結構的改變或糖基化位點出現異常，而蛋白質糖基化改變與細胞的生物學效應密切關聯，如對腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉移等產生較大影響。研究發現在垂體腺瘤中β3GnT8的表達增加,垂體腺瘤的侵襲性增強〔4〕；β3GnT8在膠質瘤中高表達,且促進膠質瘤轉移〔5〕。

在腫瘤細胞的浸潤性生長過程中,細胞外基質(ECM) 的降解為腫瘤細胞的遷移提供了足夠的空間。蛋白水解酶MMPs幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分,在腫瘤侵襲轉移中起重要作用。其中MMP-2的高表達與腫瘤細胞的高侵襲能力呈正相關,楊萬廣等〔6〕研究發現,MMP-2在結腸癌組織中呈顯著高表達,由此推測MMP-2的高表達可能與結腸癌的高轉移特性有關。CD147是一種高度糖基化的細胞跨膜蛋白，在許多腫瘤細胞中常高度表達，本研究結果表明肺腺癌A549細胞β3GnT8和MMP-2、CD147的表達呈正相關。有研究報道,β3GnT8在喉癌細胞中高表達,且通過改變MMP-2/基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-2比值影響癌細胞的增殖和侵襲〔7〕；β3GnT8通過CD147/MMP-2/Gallectin3軸促進結腸癌細胞的轉移〔8〕;肝癌的發生發展中，其侵襲轉移與β3GnT8通過c-Jun依賴的方式調控HG-CD147的糖基化有關〔9〕;β3GnT8可通過調控HG-CD147的糖基化過程促進胃癌的侵襲轉移〔10〕。這些結果對我們進一步分析β3GnT8促進肺癌的侵襲轉移機制提供一定的思路。本研究推測β3GnT8可能通過影響CD147、MMP-2的表達來影響A549細胞侵襲轉移，其具體機制有待進一步分析研究。