猴源DDX3X基因的克隆及生物信息學分析

楊 洪，田 浪，張升波，張喜懿，溫貴蘭*，程振濤，王開功，周碧君

(1.貴州大學 動物科學學院 預防獸醫實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物生物制品工程技術研究中心，貴州 貴陽 550016)

DEAD-box家族蛋白是一類ATP依賴的RNA解旋酶，在RNA代謝的過程中發揮重要作用[1]，可通過調節和抑制癌基因的表達及腫瘤相關信號通路等影響細胞的增殖、分化與凋亡，進而發揮促癌或抑癌的作用[2]。有研究顯示，DDX3X基因特異突變可導致發育障礙和智力殘疾或發育遲緩等現象[3]，并且可能影響女性和男性之間疾病傳播和表型變異，DDX3X對正常發育和疾病具有劑量依賴性和性別特異性影響。有研究報道，在胚胎發育過程中，靶向敲除小鼠DDX3X基因后，導致外胚層廣泛凋亡和異常生長，最終胚胎發生消融并且死亡[4]。DEAD-box蛋白家族是RNA解旋酶中最大的亞家族，其具有9個保守結構域，因motifyⅡ的保守氨基酸序列Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD)而命名[4]。DEAD-box解螺旋酶蛋白家族在各種生物體內普遍存在并且結構上高度保守，主要包括DEAD-box RNA解螺旋酶和DEAD-box DNA解螺旋酶2大類[5]，而DDX3X是通過利用ATP產生的能量結合或者重塑RNA以及核糖核蛋白復合體的RNA解螺旋酶，其作為DEAD-box RNA解螺旋酶蛋白家族中重要成員而被廣泛研究[6]。DDX3X參與許多病毒的復制過程，如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)等[7-8]。

猴源腎細胞源于恒河猴腎上皮樣細胞，其對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)易感[9]。基于DDX3X基因的關鍵生物學功能，研究擬克隆猴源DDX3X基因，并分析其序列特征及蛋白質性質和功能結構域，旨在為后續深入研究猴源DDX3X基因與病毒間的相互作用及分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 RNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、反轉錄試劑盒和2×Es Tag Master Mix 購自康為世紀生物科技有限公司，2 000 bp DNA marker、限制性核酸內切酶EcoR I、 Xho I和pMD19-T載體購自寶生物工程有限公司，膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.1.2 儀器 供試儀器為PCR儀(ABI公司)、倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)和凝膠成像系統(Gene公司)。

1.1.3 實驗細胞 猴源腎細胞和DH5α感受態細胞由貴州大學動物科學學院預防獸醫實驗室保存并提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據NCBI公布的豬源DDX3X基因序列(登錄號HQ266638)設計特異性引物，上游引入EcoR I、下游引入Xho I作為酶切位點。上游引物(DDX3X-EcoR I-F)為GAATTCATGAGTCATGTGGCGGTGG，下游引物(DDX3X-Xho I-R )為CCCTCGAGAGTTGCCCCACCAGTCAAC，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 猴源腎細胞培養、總RNA提取及cDNA合成 將復蘇的猴源腎細胞于37℃細胞培養箱培養24 h,于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞生長狀態，待其匯合度為90%～100%時，用預冷無菌PBS清洗3次，加入1 mL Trizol于冰上裂解10 min，參照RNA提取步驟獲得總RNA，并取1 μL用DNA2000檢測純度。根據試劑盒說明書，取2 000 ng總RNA配置20 μL反轉錄體系。將反應體系先在42℃孵育40 min,然后轉入80℃水浴鍋繼續孵育5 min后置于-20℃冰箱終止反應并保存。

1.2.3 猴源DDX3X基因擴增 以猴源腎細胞cDNA為模板，構建20μL PCR反應體系(2×Es Taq Master Mix10μL,DDX3X-EcoR I-F 0.5μL,DDX3X-Xho I-R 0.5μL,模板2μL，滅菌水7μL)，并在PCR儀中94℃ 預變性4 min；94℃ 變性40 s，54℃ 退火30 s，72℃ 終止1 min，35個循環；在72℃孵育10 min終止反應，反應結束后用1.2%瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.4 猴源DDX3X基因克隆及鑒定 根據目的基因序列大小，切割特異性條帶，運用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產物。將純化產物于pMD-19T載體16℃水浴鍋連接過夜(膠回收產物4.5μL，pMD-19T 0.5 mL,Solution I 5μL)。取連接產物轉化至DH5α感受態細胞中(冰浴30 min，42℃熱激90 s,冰浴3 min,加入900μL LB培養液，于37℃ 160 r/min搖床搖1.5 h,5 000 r/min,離心5 min，取200 μL轉化產物涂布至氨芐抗性的LB培養基中，37℃培養16～24 h),挑取4個單菌落進行培養，并進行菌液PCR及重組質粒的雙酶切鑒定。反應體系為：重組質粒8 μL，10×Buffer 2 μL,EcoR I 1 μL,EcoR I,Xho I 1 μL,滅菌水8 μL。

1.2.5 猴源DDX3X基因序列及蛋白質特性分析 使用Megalign及MEGA6軟件進行基因同源性比對及遺傳進化樹的構建，參照在線軟件Protpara(https: //web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析猴源DDX3X蛋白理化性質，SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/change_mode.PL)分析猴源DDX3X蛋白的功能結構域；SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.PLpage= npsa_sopma.html)分析猴源DDX3X蛋白的二級結構；SWISS MODEL(http://swiss model.expasy.org/interactive)分析猴源DDX3X蛋白的三級結構；STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)預測分析DDX3X蛋白的相互作用蛋白。

2 結果與分析

2.1 猴源DDX3X基因PCR擴增

以猴源腎細胞cDNA為模板進行RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，在2 000 bp左右出現單一目的條帶(圖1)，與預期結果相符合。

注：M:DL2000 Marker；1:猴源DDX3X基因。

Note: M,DL 2000 Marker; 1,monkeyDDX3Xgene.

圖1 猴DDX3X基因PCR擴增結果

Fig.1 PCR amplification of monkeyDDX3Xgene

2.2 猴源DDX3X基因克隆及鑒定

在培養的4個菌落中，3個菌液出現預期大小的特異性目的條帶。選擇1號菌液進行擴大培養，提取質粒進行雙酶切鑒定，酶切結果出現2 000 bp左右目的條帶與載體條帶(圖2)。將已鑒定的陽性質粒送華大基因有限公司測序，測序結果顯示，猴源DDX3X基因核苷酸序列大小為1 989 bp(圖3)。

注：M:DL2000 Marker； 1、2、3、4均為猴源DDX3X基因。

Note: M,DL 2000 Marker; 1～4,monkeyDDX3Xgene

圖2 猴源DDX3X基因克隆菌液PCR鑒定

Fig.2 PCR identification of monkeyDDX3Xgene

2.3 猴源DDX3X基因氨基酸序列分析

將測序所得猴源DDX3X氨基酸序列與GenBank中不同物種的DDX3X氨基酸進行同源性比，結果(圖4)顯示，猴源DDX3X氨基酸序列與獼猴同源性最高，為99.6%；與人、亞馬遜松鼠猴、貓頭鷹猴的同源性次之，分別為98.9%、98.2%和97.8%；與馬、虎、犬、家貓、綿羊、野豬、牛、家兔、大熊貓等的同源性為91.2%～95.9%；與雞、蛇、魚、鴨、雁等的同源性為57.5%～77.3%。猴源DDX3X與哺乳動物的同源性較高，較為保守；而與非哺乳動物同源性相對較低。通過遺傳進化樹構建(圖5)進一步發現，猴源DDX3X氨基酸序列與獼猴處于同一分支，親緣關系最近。

注：M:DL5000 Marker；1：重組質粒雙酶切；2：空載體酶切鑒定。

Note: M,DL 5000 Marker; 1,double enzyme digestion of recombinant plasmid; 2,enzyme digestion identification of empty carrier

圖3 猴源DDX3X基因重組質粒雙酶切鑒定

Fig.3 Identification of monkeyDDX3Xrecombinant plasmid by double enzyme digestion

圖4 猴源DDX3X氨基酸同源性比對

圖5 猴源DDX3X氨基酸序列系統進化樹

2.4 猴源DDX3X蛋白理化性質

蛋白理化性質分析顯示，猴源DDX3X基因共編碼662個氨基酸，理論蛋白分子質量為73 243.42 kDa，蛋白分子式為C3189H4962N938O1008S21，總原子數10 118個，理論等電點為6.73。猴源DDX3X蛋白是由20種氨基酸(甘氨酸含量最高，為11.5%)組成的脂溶性不穩定蛋白。

2.5 猴源DDX3X蛋白高級結構

蛋白質二級及三級結構預測結果表明，猴源DDX3X蛋白二級結構以α螺旋和無規則卷曲為主，分別占50.45%和28.4%；而β-折疊及β-轉角的占比較少，分別為14.2%和6.95%。通過三級結構模型進一步表明該蛋白以α螺旋和無規則卷曲為主(圖6)，與二級結構預測相符。

圖6 DDX3X蛋白質三級結構模型

Fig.6 Protein tertiary structure model of monkeyDDX3Xgene

2.6 猴源DDX3X蛋白功能結構域預測

蛋白功能結構域預測結果(圖7)表明，猴源DDX3X蛋白主要存在2個核心功能結構域，分別是分布在199～418位的是DEAD-Like解旋酶超家族(DEXDc)氨基酸結構域及455～536位的解旋酶超家族C端(HELICc)氨基酸結構域。

圖7 猴源DDX3X蛋白的保守功能結構域

Fig.7 Conservative functional domain of monkey DDX3X protein

2.7 DDX3X蛋白相互作用蛋白預測

蛋白相互作用蛋白預測結果(圖8)顯示，猴源DDX3X蛋白與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(TBK1)、細胞分裂周期蛋白5(CDC5L)、核因子kappa B激酶(IKBKE)、真核起始因子4E家族(EIF4E)、U5小核核糖核蛋白組分亞型a(EFTUD2)、泛素特異性肽酶9(USP9X)、前mRNA處理因子6(PRPF6)、核翻譯起始因子1A(EIF1AX)及Aly/REF輸出因子(THOC4)等調節細胞進程、RNA加工等關鍵環節的蛋白均存在相互作用。

圖8 猴源DDX3X蛋白的相互作用蛋白

Fig.8 Inter-acting protein of monkey DDX3X protein

3 結論與討論

研究成功從猴源腎細胞中擴增獲得猴源DDX3X基因，基因全長1 989 bp，編碼662個氨基酸。生物信息學分析顯示，猴源DDX3X基因氨基酸序列與獼猴同源性最高，為99.6%；與人及其他猴類次之，與其他非哺乳動物同源性較低，表明其保守性較強。蛋白質理化性質預測顯示，DDX3X蛋白理論分子質量為73 243.42 kDa，是由20種氨基酸組成的脂溶性不穩定蛋白。DDX3X蛋白質二級結構以α螺旋和無規則卷曲為主(50.45%和28.4%)，而β-折疊及β-轉角較少(14.2%和6.95%)，分別存在DEAD-Like解旋酶超家族(DEXDc)氨基酸結構域及解旋酶超家族C端(HELICc)氨基酸結構域，并且與調控細胞周期、調節RNA加工等多種關鍵蛋白存在相互作用。

DDX3X是DEAD-box RNA解旋酶家族的成員，位于人類X染色體p11.3～p11.23上[10-11]。有研究報道，DDX3X參與多種基因調控事件，包括轉錄調控、RNA解旋、剪接、RNA核輸出、核糖體生物發生和mRNA翻譯[12]。因此，DDX3X被認為參與基因表達的表觀遺傳調控，研究顯示，DDX3X雖然在物種之間高度保守，但發揮的功能千差萬別，如小鼠和人的DDX3X同源型高達99%，而行使的功能卻不一致[13]。已有研究者將DDX3X基因作為癌癥治療的靶基因來治療肺癌患者體內EGFR激活的異質性[14]。

將克隆的序列進行同源性比對及遺傳進化樹的分析發現，DDX3X基因氨基酸序列在哺乳動物均有較高相似性，證明該基因在物種進化過程中高度保守。蛋白質功能結構域預測顯示，猴源DDX3X蛋白存在DEAD-Like解旋酶超家族(DEXDc)氨基酸結構域及解旋酶超家族C端(HELICc)氨基酸結構域。在此之前，有研究者已報道過其他物種的DDX3X均含有類似的2個功能結構域，并且參與機體多種生物學調節過程[15-16]。相關研究表明，DDX3X參與了HIV、VSV、VACV、HCV和HBV等5個病毒的復制過程，作為主要表達于細胞質的蛋白，通過將豬藍耳病病毒PRRSV感染PAM細胞后可上調DDX3X基因的表達并抑制病毒的復制,并且DDX3X可通過調節干擾素β啟動刺激因子及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的表達來介導β干擾素的產生，從而誘發機體的免疫應答以對抗病毒的感染及復制[17]。

通過同源性比對及遺傳進化樹證明DDX3X基因序列在不同物種進化過程中高度保守，而其保守結構域主要是DEXDc氨基酸結構域及HELICc氨基酸結構域，而該結構域正是該蛋白行使主要生物學進程的功能區。成功克隆獲得的猴源DDX3X基因與劉琴等克隆獲得的豬DDX3X基因編碼氨基酸數量一致，進一步證明其在不同物種中保守性較高[17]。 在禽類動物的研究中，研究者將鴨坦布蘇病毒(DTMUV)感染BHK-21細胞之后進行轉錄組及蛋白組學分析，DDX3X基因作為差異基因被發現，通過熒光定量PCR及WB驗證發現，DDX3X及DDX5基因mRNA水平及蛋白水平均受到抑制。此外為驗證DDX3X基因參與病毒復制過程，研究者向BHK-21細胞轉染DDX3X基因特異性干擾siRNA,并于轉染后用DTMUV感染BHK-21細胞，通過血凝和血凝抑制試驗發現，干擾DDX3X基因后，病毒的復制能力增強[18]。

目前雖然發現豬DDX3X基因的表達對PRRSV易感及相關病毒復制存在關聯性，但具體相互作用機制還不夠清晰[19-20]。由于病毒研究存在較高不可控性，利用活體研究病毒的相關生物學過程代價較高，本次成功從猴源腎細胞中擴增到DDX3X基因，并對其進行基因同源性及相關蛋白質性質、高級結構及保守功能結構域及相互作用蛋白的分析，將為后期厘清DDX3X基因介導的病毒易感及復制的相關機制提供理論數據。