膠陀螺菌絲體液態發酵條件及體外抗氧化活性分析

鐘 寶， 李應華， 李鳳林， 劉 超， Youn-Soo Cha

(1.吉林農業科技學院 食品工程學院, 吉林 吉林 132101； 2.漯河職業技術學院 食品學院, 河南 漯河 462002； 3.韓國全北國立大學 食品科學與人類營養， 韓國 全羅北道 全州 54896)

膠陀螺〔Bulgariainquinans(Pers.) Fr.〕又名拱嘴蘑、豬嘴蘑，屬子囊菌綱蠟釘菌目膠陀螺科膠鼓菌屬；其子囊盤黑褐色，較小且似陀螺狀、豬咀狀而得名。膠陀螺主要分布于我國的吉林、遼寧和黑龍江等省，夏秋季生于樺樹、柞樹、榆樹的倒木和木樁上，陰雨后大量出現。該菌為藥食兼用真菌，被廣泛用于食品和醫藥行業。其菌絲體含有大量多糖和苯并[j]熒蒽類、Azaphilone 類化合物，具有抗癌、抗菌作用，同時對血淤患者血流流變性可產生影響，如可增強紅細胞變性能力，降低血液粘稠度[1]；其獨特的口感和豐富的營養價值使其近年來深受各國消費者青睞。由于膠陀螺生長季節性強，且隨著森林環境日漸惡化，其資源量呈逐年減少趨勢，產量少且不穩定，產品質量不能保證，無法滿足商品化、市場化的需求，致使膠陀螺一直得不到有效的開發和利用。與子實體培養相比，液態發酵菌種具有生長周期短、營養價值高及產量大等優點[2]。目前，關于膠陀螺的研究主要集中在子實體化學成分分離、鑒定、藥理活性分析及膠陀螺光敏毒性成分鑒定分析等方面，對菌絲體的研究較少。鑒于此，對膠陀螺菌絲體的液態發酵培養條件進行篩選，同時對體外抗氧化活性進行分析，以期為膠陀螺菌絲體液態培養及其作為潛在的抗氧化劑開發提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1膠陀螺膠陀螺一級菌種，由蛟河市黃松甸鎮食用菌合作社提供。

1.1.2試劑葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、蛋白胨、酵母浸膏、花生餅粉、硫酸銨、硝酸銨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、馬鈴薯、瓊脂粉、純水、VB1和VC，均為分析純或化學純。

1.1.3儀器設備SW CJ ZD超凈臺，蘇州凈化儀器有限公司；HVE.50滅菌鍋，日本Hirayama公司；PHS.3C pH計，上海科學儀器股份有限公司；TDL.5-A離心機，上海安亭科學儀器廠；UV-2660紫外分光光度計，日本島津儀器有限公司；TG328A分析天平，上海天平儀器廠；FD-T12N-80冷凍干燥機，上海勝衛電子科技有限公司；BS-2F數顯振蕩培養箱，北京金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2方法

1.2.1材料預處理

1) 培養基的制備。馬鈴薯汁2%(馬鈴薯去皮煮沸取汁)，葡萄糖0.25%，瓊脂0.2%，VB10.02%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 1%，水1 000 mL，121℃滅菌30 min備用。

2) 發酵培養液的制備。碳源4%，氮源0.3%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 1%，VB10.02%，水1 000 mL，121℃滅菌30 min備用。

3) 種子制備及液態培養。參照文獻[3-5]的方法，選擇菌種生長旺盛的斜面培養基，將其分割成2小塊，其中1塊在無菌條件下接種在100 mL培養液中，在25℃、150 r/min條件下搖床培養7 d，另一塊保存備用；將培養好的種子液以接種量10%接種至250 mL培養液中，在25℃、150 r/min條件下搖床培養6 d，收集菌絲體，通過計算菌絲體干重(mg)與發酵液體積(mL)的比例得到菌絲體的生物量。

1.2.2不同因素對膠陀螺菌絲生長的影響

1) 碳源和氮源確定。碳源是菌絲體生長的重要物質基礎，合適的碳源能使菌絲體的生物量增加。氮源是液態發酵過程中菌種細胞合成蛋白質、核酸的重要物質。

碳源。設5個處理，即在基礎培養基中分別添加4%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉及玉米粉作為碳源，將膠陀螺菌絲體接種于碳源篩選培養基/液中，3次重復，在25℃、150 r/min條件下搖床培養，接種后每隔24 h測量1次，其測6次，參照文獻[6]的方法計算菌絲生長量。選取菌絲生長量最大、菌絲最為濃密的碳源為最佳碳源。

氮源。設5個處理，即在基礎培養基中分別添加0.3%的蛋白胨、酵母浸膏、花生餅粉、硫酸銨和硝酸銨作為氮源，將膠陀螺菌絲體接種于氮源篩選培養基/液中，3次重復，在25℃、150 r/min條件下搖床培養，接種后每隔24 h測量1次，共測6次，計算菌絲生長量。選取菌絲生長量最大、菌絲最為濃密的氮源為最佳氮源。

2) 液態培養基發酵條件。在上述試驗的基礎上分別對培養基組分最佳碳源(葡萄糖)、氮源(酵母浸膏)、KH2PO4和MgSO4·7H2O的用量進行篩選，通過測定菌絲體生物量及胞外粗多糖含量[7-8]，確定液態發酵培養基各組分的最佳用量。

葡萄糖。設5個處理，即葡萄糖的添加量分別為2%、3%、4%、5%和6%，酵母浸膏添加量為0.3%，KH2PO4添加量為0.5%，MgSO4·7H2O添加量為1.0%。

酵母浸膏。設5個處理，即酵母浸膏的添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，葡萄糖添加量為4%，KH2PO4添加量為0.5%，MgSO4·7H2O添加量為1.0%。

KH2PO4。設5個處理，即KH2PO4的添加量分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%，葡萄糖添加量為4%，酵母浸膏添加量為0.3%，MgSO4·7H2O添加量為1.0%。

MgSO4·7H2O。設5個處理，即MgSO4·7H2O的添加量分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和1.4%，葡萄糖添加量為4%，酵母浸膏添加量為0.3%，KH2PO4添加量為0.5%。

3) 響應面試驗。選擇葡萄糖(A)、酵母浸膏(B)、KH2PO4(C)和MgSO4·7H2O(D)為主要影響因素，以菌絲體生物量(Y)為響應值，運用Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken設計，對膠陀螺菌絲體液態發酵培養基進行優化，并進行響應面分析，篩選最佳的發酵培養基條件。試驗因素與水平方案見表1。

表1膠陀螺菌絲體液態發酵培養基響應面試驗的因素與水平

Table 1 Factors and levels of response surface test of liquid fermentation medium ofB.inquinansasmycelium %

因素 Factor水平 Level-101葡萄糖(A)Glucose345酵母浸膏(B)Yeast extract0.20.30.4KH2PO4(C)0.30.50.7MgSO4·7H2O(D)0.81.01.2

1.2.3膠陀螺菌絲體的抗氧化活性取100 mL發酵液，在4℃、6 000 r/min的條件下離心8 min，吸出上清液，收集沉淀，并使用超純水反復洗滌3次后進行真空冷凍干燥，獲得菌絲體，然后將菌絲體分別配置成不同濃度的溶液，放入超聲細胞粉碎機中超聲5 min，在4℃、6 000 r/min的條件下離心5 min，取上清液待用。

1) DPPH自由基的清除能力。DPPH自由基清率(Y1)參照吳林秀等[9-11]的方法并加以改進后測定。取0.5 mL濃度分別為0.5%、0.7%、0.9%、1.1%及1.3%的待測液，加入0.5 mL DPPH溶液混勻，放在暗室中反應1 h后離心取上清液，在515 nm處測定吸光度(A1)；再取0.5 mL蒸餾水分別與0.5 mL的不同濃度樣品和0.5 mL的DPPH混合在515 nm處測定吸光度(A2、A3)，采用VC作為陽性對照。

2) ABTS自由基的清除能力。ABTS自由基清率(Y2)參照陳旭峰等[12-14]的方法并加以改進后測定。取濃度分別為0.5%、0.7%、0.9%、1.1%及1.3%的待測液0.5 mL，加入0.5 mL ABTS 溶液，混勻后放在暗室中反應20 min，進行離心取上清液，在732 nm處測定吸光度(B1)。再取0.5 mL蒸餾水分別與0.5 mL的不同濃度的樣品和0.5 mL的ABTS 混合，在732 nm處測定吸光度(B2、B3)，采用VC作為陽性對照。

Y1=[1-(A1-A2)÷A3]×100%

Y2=[1-(B1-B2)÷B3]×100%

2結果與分析

2.1不同碳源和氮源處理膠陀螺菌絲體的生物量

碳源是菌絲體生長的重要物質基礎，合適的碳源能使菌絲體的生物量增加；氮源是液態發酵過程中菌種細胞合成蛋白質、核酸的重要物質，對液態發酵影響極大。從圖1看出，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉5種碳源對膠陀螺菌絲體生物量的影響差異較為明顯。其中，葡萄糖作為碳源膠陀螺菌絲體的生物量最高，為13.2 g/L；其次是蔗糖，菌絲體的生物量為11.5 g/L。因此，選擇葡萄糖作為發酵用碳源。蛋白胨、酵母浸膏、花生餅粉、硫酸銨、硝酸銨5種氮源對菌絲體生物量的影響存在一定差異，其中，酵母浸膏作氮源，膠陀螺菌絲體的生物量最高，為14.2 g/L；其次是花生餅粉，菌絲體的生物量為13.3 g/L。因此，選擇酵母浸膏作為最優氮源。

圖1不同碳源和氮源處理膠陀螺菌絲體的生物量

2.2不同液態培養基發酵條件膠陀螺菌絲體的生物量和胞外多糖含量

從圖2看出，隨著葡萄糖、酵母浸膏、KH2PO4和MgSO4·7H2O添加量的增加，菌絲體生物量呈先增后減趨勢，胞外多糖含量的變化也隨添加量的增加呈先增后減趨勢。葡萄糖添加量為4%時菌絲體生物量和胞外多糖含量均達最大，分別為13.5 g/L和9.45 g/L，其最佳添加量為4%，選擇3%、4%和5%添加量進行后續試驗。酵母浸膏添加量為0.3%時菌絲體生物量和胞外多糖含量均達最大，分別為14.5 g/L和10.15 g/L，其最佳添加量為0.3%，選擇0.2%、0.3%和0.4%添加量進行后續試驗。KH2PO4添加量為0.5%時菌絲體生物量和胞外多糖含量均達最大，分別為13.0 g/L和9.1 g/L，其最佳添加量為0.5%，選擇0.3%、0.5%和0.7%添加量進行后續試驗。MgSO4·7H2O添加量為1%時菌絲體生物量和胞外多糖含量均達最大，分別為13.2 g/L和9.24 g/L，其最佳添加量為1%，選擇0.8%、1%和1.2%添加量進行后續試驗。

圖2不同液態培養基發酵條件膠陀螺菌絲體的生物量與胞外多糖含量

2.3膠陀螺菌絲體液態發酵培養基的最優配方

從表2看出，處理4和處理8膠陀螺菌絲體的生物量最高，均為14.8 g/L；其次是處理14和處理13，分別為14.7 g/L和14.6 g/L；處理18最小，為11.9 g/L。對試驗結果進行多項式擬合回歸得回歸方程為Y=14.60-0.11A-0.19B-0.017C-0.083D-0.30AB+0.000AC+0.43AD-0.17BC+0.25BD+0.23CD-1.09A2-0.64B2-1.30C2-1.00D2，模型P<0.000 1(表3)，表明試驗的二次多項式模擬極顯著，模型的R2= 0.965 1(AdjR2= 0.930 1)，說明，響應值的變化有93.01%來自所選變量；變異系數(CV)為1.81%，模型準確度較高，變異的可能性很小。同時，失擬項P值為極不顯著，說明，該模型擬合程度較好。因此，可利用該模型對膠陀螺菌絲體的液態培養條件進行優化。該模型中一次項A和二次項A2、B2、C2、D2對菌絲體生物量的影響均為極顯著，一次項B和交互項AB為顯著。各因素對膠陀螺菌絲體生物量的影響依次為A、D、C、B。

表2膠陀螺菌絲體液態發酵培養基響應面試驗的設計方案

表3膠陀螺菌絲體液態發酵培養基響應面回歸方程的方差分析

注：**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。

Note: ** indicates that the difference is extremely significant (P<0.01); * indicates significant difference (P<0.05).

從圖3看出，各響應面均為開口向下的凸形曲面，說明，響應值存在極高值。葡萄糖(A)、酵母浸膏(B)、KH2PO4(C)和MgSO4·7H2O(D)4個因素之間彼此存在交互影響。通過線性回歸方程得出膠陀螺菌絲體液態發酵培養基的最優配方：葡萄糖添加量為4.6%、酵母浸膏添加量為0.3%、KH2PO4添加量為0.5%和MgSO4·7H2O添加量為1%。此條件下膠陀螺菌絲體的生物量為14.95 g/L。

圖3不同因素交互作用膠陀螺菌絲體的生物量響應面

2.4膠陀螺菌絲體的抗氧化活性

從圖4可知，低濃度的膠陀螺菌絲體對DPPH自由基和ABTS自由基均具備清除能力，且隨著濃度的增加該清除能力呈遞增趨勢。DPPH自由基作為一種抗氧化的反應，在515 nm處的吸光度有特征吸收峰。當菌絲體和VC濃度增至1.3 mg/mL時，對DPPH和ABTS自由基清除率分別為68.25%、78.38%和82.17%、85.78%,VC的清除能力均略高于菌絲體的。

圖4膠陀螺菌絲體對 DPPH和 ABTS自由基的清除率

3結論與討論

研究結果表明，在葡萄糖、酵母浸膏、KH2PO4和MgSO4·7H2O添加量分別為4.6%、0.3%、0.5%和1%時，膠陀螺菌絲體液態發酵的效果最佳，菌絲體生物量為14.95 g/L。膠陀螺菌絲體對DPPH和ABTS自由基均具備清除能力，當其濃度為1.3 mg/mL時，清除率分別達68.25%和78.38%。膠陀螺自然發酵液中富含多種氨基酸和無機元素，同時含有檸檬酸和酒石酸等物質[15]；膠陀螺子實體含有蛋白質、脂肪和糖等多種營養成分，氨基酸含量達6.84%[16]；膠陀螺子實體對水相對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌均有一定抑制作用[17]；同時，前人對膠陀螺中含有的光敏活性物質進行過相關分析，并提出了相應的處理辦法[18]。在今后研究中應該加強對液態發酵物營養成分以及抑菌功效的測定，同時，對液態發酵狀況下光敏活性物質進行檢測研究，為后續的動物試驗及未來相關產品開發提供安全保障。