中藥單體成分調控自噬治療膿毒癥研究進展?

李國臣 孔 立 王為為 田正云 郝 浩 張飛虎

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250011）

膿毒癥由嚴重的感染，創傷或內毒素引發的人體對感染反應失衡而導致的危及生命的器官功能障礙[1]。膿毒癥是嚴重威脅人類健康的重大疾病，近年來盡管在藥物治療和器官支持方面取得了巨大進步，并且對膿毒癥的病理生理學有了更多的了解，但它仍然是ICU患者死亡的主要原因[2-3]。國內一項回顧性研究顯示，我國標準化膿毒癥相關死亡率66.7/10萬，年齡每增加5歲，死亡風險升高1.914倍[4]，膿毒癥已成為醫療、社會沉重負擔。因此，迫切需要了解膿毒癥發病機理的新機制并尋找新的治療策略。

自噬是指細胞通過生物膜結構包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質形成自噬體，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以實現細胞穩態和細胞器更新的一種自我吞噬循環過程[5]。近年來研究發現，自噬是免疫反應的關鍵調節劑，它參與了免疫細胞殺滅病原體或處理、呈遞抗原的整個過程，這些都突顯了其作為感染性疾病（包括膿毒癥）的治療靶標的潛力[6-7]。多項研究表明自噬與膿毒癥之間關系密切，貫穿膿毒癥的始終。近年來中醫藥研究方興未艾，越來越多的研究證實中藥單體成分在調控自噬防治膿毒癥方面具有一定作用。本文主要從自噬、膿毒癥與自噬及中藥相關成分3個方面對近年來研究做一綜述。

1 自 噬

自噬可簡單解讀為“細胞的自我消化”，細胞可通過自噬降解胞質內細胞器及大分子物質，降解后產生的氨基酸、核苷酸和小分子物質等被細胞再次利用，為胞內新細胞器的構建提供原料，實現細胞內原料物質的再循環[5]。根據細胞內底物運送到溶酶體腔方式的不同，細胞自噬可分為3種主要類型：微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬。其中巨自噬是最普遍的一種，即通常所說的自噬。細胞自噬的發生過程主要包括4個階段，即底物誘導自噬前體的形成、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合和自噬體內容物被降解。在即將發生自噬的細胞胞質中會出現許多游離雙層膜結構，稱為自噬前體。自噬前體進一步被誘導形成杯狀凹陷，包裹細胞質中損傷或衰老的細胞器（如線粒體、內質網等），形成自噬體，然后與溶酶體融合成自噬溶酶體。在自噬溶酶體中，其內容物被重新降解成各種底物和小分子物質，供細胞再次利用。自噬主要受自噬相關基因（Atgs）調節，目前已知的已有30多種[8-9]。微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）和Beclin-1均是重要的自噬體標志性蛋白，當自噬啟動后，胞質型LC3-Ⅰ轉位到自噬體膜LC3-Ⅱ是自噬體形成的標志，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平、Beclin-1表達可反映自噬水平[5]。目前發現的自噬通路主要包括依賴雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的自噬和不依賴mTOR的自噬[10]。

2 膿毒癥與自噬

自噬一般被認為是細胞的自救行為，當生物體受到各種應激時，自噬可執行細胞凋亡程序以及激活固有的適應性免疫反應，能夠協助生物體對抗多種疾病。近年來的研究表明，膿毒癥的發病機制極其復雜，與炎癥風暴、氧化應激、凝血異常、缺血-再灌注損傷及機體多部位屏障功能破壞引發二次感染等多種因素相關[11]。多項研究表明自噬與膿毒癥之間聯系密切，基礎研究已證實自噬在膿毒癥患者和盲腸結扎和穿刺（CLP）動物模型中均被激活[12]。此外，一項多中心前瞻性隊列研究表明，IRGM（免疫相關GTPase家族，M）基因中自噬相關基因的多態性與膿毒癥的過度死亡率相關[13]。自噬作為細胞的適應性調節機制，貫穿于膿毒癥始終。

2.1 膿毒癥誘導自噬機制 膿毒癥時自噬主要是通過微生物結構中病原體相關分子模式與模式識別受體（如toll樣受體）的結合被誘導，進一步激活不同的細胞內事件，并通過促進LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化而增強自噬活性。主要有以下兩個通路[14-15]。1）TLR4（toll樣受體4）：膿毒癥時革蘭氏陰性病原體的脂多糖與TLR4的結合被激活。通過MAPK/p38（促分裂原激活的蛋白激酶）信號軸促進自噬，而脂磷壁酸與TLR2的結合則通過MAPK1/ERK2-MAPK3/ERK1途徑誘導自噬。2）線粒體自噬：膿毒癥時嚴重感染會觸發促炎性細胞因子的釋放及活性氧的產生，這些活性氧會增加氧化應激和線粒體損傷。這通常表現為線粒體膜電位喪失和CYCS（細胞色素c，體細胞）釋放到胞質溶膠中。內質網應激的增加會上調HSPA5/GRP78蛋白的表達，進而使內質網定位的跨膜蛋白EIF2AK3/PERK和EIF2S1磷酸化。損壞的線粒體募集蛋白，例如PARK2，BNIP3L和BNIP3，會對靶向細胞器進行線粒體吞噬。線粒體自噬在隔離這些失活的細胞器中起著重要作用，可防止進一步加劇促炎反應并最小化對宿主的氧化損傷。

2.2 膿毒癥中自噬的動力學和差異性 膿毒癥病理機制復雜，初期為失控的全身炎癥反應，后期多為機體免疫抑制，因而膿毒癥時自噬的活性不是一成不變的，同時不同組織器官自噬活性也存在差異性[15]。動物實驗研究發現，在CLP造模后的最初4～6 h內，自噬體數量增加，自噬活性升高，而8 h后自噬溶酶體（自噬體與溶酶體融合的產物）的數目開始減少，說明自噬活性降低[16]。在最初時，肝細胞和心肌細胞率先顯示出較高的LC3-Ⅱ∶LC3-Ⅰ比（自噬誘導的標志），另一項研究也觀察到了相同的自噬變化[17]。這表明膿毒癥時，初期自噬在短暫的過度活躍后，后期自噬會受到抑制。同時，肝細胞和心肌細胞顯示出更高的自噬誘導水平可能是對敗血癥誘導的自噬反應的主要細胞類型。進一步明確膿毒癥時自噬動力學和差異性，有利于尋找膿毒癥新的治療策略。

3 中藥單體成分調控自噬治療膿毒癥的研究進展

較多研究已證實自噬在膿毒癥進展與器官功能障礙的形成中具有一定保護作用，是一個值得研究的治療靶點，但目前尚沒有可以應用于臨床的自噬特異性調控藥物。近年來，中醫藥在膿毒癥的救治方面起到越來越重要的作用，與西醫的作用靶點及機理較為單一相比，中醫藥的優勢在于可以從整體出發對膿毒癥進行辨證施治。自噬作為膿毒癥發展過程中重要的保護機制，已備受中醫藥研究者關注并深入挖掘，目前已經發現，一些中藥的單體成分可通過調節自噬來抑制膿毒癥時全身炎癥反應綜合征（SIRS）和器官功能保護。

3.1 炎癥反應 機體失控性炎癥反應學說被認為是膿毒癥發病機制的重要基礎[11]。膿毒癥患者大都存在一定程度的免疫功能受損，從而喪失了感染早期對促炎和抗炎反應的調控，促炎與抗炎作用的失衡將會啟動炎癥級聯反應，引起SIRS。自噬在負向調控炎癥反應中發揮著重要的作用，自噬通路與炎癥反應存在多個交叉，二者之間聯系密切[18-19]。近年來研究發現中藥單體成分在調控自噬抑制膿毒癥炎癥反應方面具有一定的作用。研究表明[20]，青藤堿能減輕CLP小鼠的炎癥反應，并能抑制LPS引起的巨噬細胞炎癥。彭玥等繼而通過體外實驗證實[21]，青藤堿能減輕LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥，且其對炎癥的調控作用與HO-1介導的細胞自噬激活相關。Mei等研究發現[22]，青蒿虎酯能夠抑制LPS誘導的raw264.7細胞、小鼠骨髓源性單核細胞和腹腔巨噬細胞釋放TNF-α和IL-6。使用自噬抑制劑3-MA、bafilomycin A1或靶向ATG5基因的siRNA抑制自噬時，青蒿虎酯對LPS誘導的細胞因子釋放的抑制作用被減弱。進一步證明，青蒿琥酯在一定程度上通過激活自噬，抑制巨噬細胞釋放促炎細胞因子，從而減輕過度的炎癥反應及后續的器官損傷。

3.2 器官保護 自噬在膿毒癥狀態下對重要臟器功能的保護作用已較為明確，相關基礎研究相繼在膿毒癥模型動物的肝、肺、心、腦等重要臟器中發現自噬體及相關蛋白表達增高[23]，并證實與膿毒癥發展過程密切相關。膿毒癥時誘導細胞自噬可以減輕器官功能損傷起到保護作用，抑制自噬會加重重要臟器功能障礙，對膿毒癥預后產生不良影響。近年來多項基礎研究證實，中藥單體成分在調控自噬保護膿毒癥臟器功能方面具有重要作用。1）肺保護。研究表明[24]，人參的有效成分人參皂苷Rg1可通過提高自噬水平抑制LPS引起的小鼠肺上皮細胞的凋亡，減輕肺間炎癥浸潤，肺損傷程度明顯減輕。此外，大蒜素可保護膿毒癥導致的急性肺損傷，其保護膿毒癥肺損傷的機制除了與大蒜素的抑制炎癥反應和氧化應激有關外，還與其調控自噬有關[25]。CLP動物模型中，大蒜素治療可使實驗小鼠肺組織LC3Ⅱ和Beclin-1表達增高，表明大蒜素可通過上調小鼠肺組織自噬水平，有效減輕膿毒癥肺損傷。2）心臟保護。丹酚酸B是中藥丹參中含量最豐富的水溶性物質，有研究發現丹酚酸B能上調膿毒癥大鼠心肌組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin-1表達，增強自噬反應，降低膿毒癥大鼠心肌炎癥反應和氧化應激，抑制心肌細胞凋亡，從而減輕膿毒癥大鼠心肌的損傷[26]。Li等的研究表明[27]，芹菜素通過調節氧化應激和細胞因子（TNF-α、IL-1β、MIP-1α和MIP-2）的表達及其主要調節因子NF-κB，能夠減輕內毒素誘導的心肌損傷，并證實其抗炎作用可能與調控自噬有關。芹菜素可能通過調節ATG5、P62基因誘導自噬，控制膿毒癥早期失控的炎癥反應，進而降低膿毒癥器官損傷。3）腦保護。川芎嗪是中藥川芎的有效成分，朱浩等的研究顯示[28]：川芎嗪能夠減輕大鼠膿毒癥相關性腦病，其機制與抑制海馬神經元自噬有關。CLP制備膿毒癥大鼠模型，Morris水迷宮實驗評估腦病程度，研究結果顯示，大鼠腹腔注射川芎嗪后較對照組海馬LCⅡ/Ⅰ比值升高，Beclin-1表達上調，P62表達下調，表明自噬水平上升。4）肝保護。梔子苷又名京平尼苷，是中藥梔子的有效成分。研究發現梔子苷可降低CLP小鼠血清中的氨基轉移酶和促炎細胞因子水平，保護肝功能。通過對其作用機制研究發現，梔子苷能上調自噬相關蛋白（Atg）12-Atg5偶聯物和Atg3蛋白在肝臟的表達，減緩了溶酶體相關膜蛋白2和Rab7蛋白的表達下降，并增加了CLP誘導的鈣蛋白酶1蛋白在肝臟中的表達，恢復自噬通量[29]。通過反證法證實梔子苷的這一效果能被自噬抑制劑氯喹抑制，進一步證實，梔子苷可通過恢復受損的自噬通量來預防膿毒癥肝損傷，可能是膿毒癥的潛在治療劑。人參皂苷是中藥人參中的一種固醇類化合物。研究發現人參皂苷Rg3處理LPS誘導的人原代肝細胞可觀察到更低的ROS值和更高的MTP值，并能維持GSH池及其結合活性。通過對其作用機制的研究發現，這一作用與其激活AMPK信號通路上調自噬相關蛋白，抑制線粒體功能障礙，保護肝細胞線粒體功能障礙有關[30]。人參皂苷Rg3的保護作用可被自噬抑制劑或AMPK抑制劑減弱，也反向驗證了這一點。

4 結 語

近年來，膿毒癥的總體診療水平明顯進步，重癥監護病房支持治療水平也大幅提高，但膿毒癥死亡率仍未見明顯降低。自噬作為新認識到的重要的細胞學事件，與膿毒癥的關系密切，值得深入探索及尋找與其相關的膿毒癥治療靶點。目前許多基礎實驗已經證實，中藥單體成分可以通過調控自噬來防治膿毒癥，如青藤堿、青蒿琥酯可通過調控自噬來減輕膿毒癥時失控的炎癥反應；川芎嗪、梔子苷、人參皂苷等可激活自噬，發揮膿毒癥時重要器官保護的作用。中醫藥是中醫學的偉大寶庫，如何更好地運用現代技術深入挖掘其在治療膿毒癥中的重要靶點和優勢作用，為膿毒癥的治療尋找更為有效的干預方法，仍是需要中醫藥研究者們繼續探索的問題。