機(jī)械敏感分子踝蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化

李史恬 李靜 李玲

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2第一臨床醫(yī)學(xué)院；3藥學(xué)院)

理解外力刺激對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響需要運(yùn)用生物化學(xué)和生物力學(xué)相互結(jié)合的整體研究方法。近年來(lái)，顯微鏡技術(shù)和生物物理技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)展使細(xì)胞生物力學(xué)的研究向前邁出了一大步，逐漸形成了新興的生物力學(xué)學(xué)科。細(xì)胞通過(guò)黏著斑與其自身的機(jī)械環(huán)境進(jìn)行信息傳遞，踝蛋白(Talin)是黏著斑中的重要成分，連接著整合素與肌動(dòng)蛋白，可激活整合素。由于Talin與細(xì)胞機(jī)械力承載裝置的關(guān)鍵部位相結(jié)合并在受到外力刺激時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化，因此，研究認(rèn)為T(mén)alin是一種機(jī)械敏感分子，并且在整合素介導(dǎo)的力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)中占據(jù)重要地位〔1，2〕。本綜述介紹Talin的機(jī)械敏感結(jié)構(gòu)及其與結(jié)合伙伴的協(xié)同作用，討論了Talin與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的密切聯(lián)系及Talin在癌癥中的表達(dá)及調(diào)控。

1 Talin機(jī)械敏感結(jié)構(gòu)

Talin于1983年被發(fā)現(xiàn)，因從人血小板中分離獲得而得名〔3〕。Talin共有2 541個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為270 kD，由N端頭部結(jié)構(gòu)域和C端的棒狀尾部結(jié)構(gòu)域連接而成。Talin頭部呈球形，包括F0結(jié)構(gòu)域和FERM結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)ERM結(jié)構(gòu)域存在于多種連接跨膜蛋白和細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)中，由線(xiàn)性排列的F1、F2、F3子域組成；尾部的棒狀結(jié)構(gòu)域，由13個(gè)螺旋束(R1～R13)及C末端的最后一個(gè)α螺旋DD組成。兩個(gè)Talin分子的DD結(jié)構(gòu)可相互作用，介導(dǎo)Talin二聚體的形成〔4〕。棒狀結(jié)構(gòu)域的每個(gè)螺旋束由4～5個(gè)α螺旋組成，其內(nèi)部形成穩(wěn)定的疏水核心。因螺旋束種類(lèi)及排列方式的不同，可形成兩個(gè)功能不同的區(qū)域：5-螺旋束組成的線(xiàn)性排列的桿狀域和3個(gè)4-螺旋束(R2-R4)所組成的緊湊排列的結(jié)構(gòu)域，后者插入棒狀結(jié)構(gòu)域N端的R1與R5之間，R2通過(guò)其強(qiáng)大的疏水作用與R1結(jié)合成一個(gè)雙結(jié)構(gòu)域。R8雖為4-螺旋束，但因?yàn)樗⒎遣迦肓薘7與R9之間，而是插入了R7內(nèi)部的α-螺旋環(huán)中，所以并未打破5-螺旋束的線(xiàn)性排列〔5〕。通過(guò)在體內(nèi)對(duì)Talin分子單體進(jìn)行追蹤，Margardant等〔6〕證明了Talin在感應(yīng)肌動(dòng)蛋白的機(jī)械力時(shí)，會(huì)發(fā)生顯著的構(gòu)象變化。根據(jù)螺旋束的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：4-螺旋束的N端和C端在空間上緊密排列且位于結(jié)構(gòu)域的同側(cè)；5-螺旋束的N端和C端首尾相接，分別位于結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)，為線(xiàn)性排列的長(zhǎng)棒狀結(jié)構(gòu)。因此形成了Talin理想的機(jī)械力傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)。

受到較低機(jī)械力作用時(shí)，Rap1-GTP交聯(lián)受體蛋白(RIAM)與R2、R3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合占主導(dǎo)地位，協(xié)助細(xì)胞膜招募Talin、激活整合素及新生粘連的組裝。然而當(dāng)機(jī)械力大于5 pN時(shí)，R3結(jié)構(gòu)域受到機(jī)械誘導(dǎo)展開(kāi)后，RIAM結(jié)合位點(diǎn)遭到破壞，從而向紐蛋白(Vinculin)-Talin復(fù)合物過(guò)渡，促使新生黏附物成熟為黏著斑〔1〕。

2 Talin對(duì)整合素的激活

整合素是一種跨膜蛋白，其胞外基質(zhì)(ECM)成分可將外界應(yīng)力刺激傳遞到細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)β亞基胞內(nèi)域與Tain N末端FERM域直接相連，將外界機(jī)械應(yīng)力刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)化學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)力-化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程〔7〕。整合素介導(dǎo)的黏附物機(jī)械敏感性允許組織調(diào)整其功能和基因表達(dá)以適應(yīng)環(huán)境中的機(jī)械信號(hào)〔8〕。整合素激活伴隨著其胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化，Talin的一個(gè)重要功能就是將整合素轉(zhuǎn)化為與ECM配體高親和力結(jié)合的構(gòu)象，即所謂的“由內(nèi)而外”激活。從細(xì)胞內(nèi)部調(diào)控整合素活性對(duì)造血細(xì)胞尤其是血小板和淋巴細(xì)胞尤為重要〔9〕。

帶負(fù)電荷的磷脂酞肌醇(PI)對(duì)分布在Talin蛋白FERM結(jié)構(gòu)域一側(cè)的連續(xù)堿性殘基有靜電吸引作用，使得Talin靠近細(xì)胞膜，Talin依靠頭部F3亞結(jié)構(gòu)域上的類(lèi)磷酸酪氨酸結(jié)合(PTB)結(jié)構(gòu)域與整合素β亞基胞內(nèi)天冬酰胺-脯胺酸-Xaa-酪氨酸(NPxY)序列結(jié)合，使整合素的α、β亞基之間鹽鍵斷裂，導(dǎo)致整合素活化，進(jìn)而引發(fā)下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔5〕。研究表明，肌動(dòng)蛋白聚合和肌凝蛋白收縮所產(chǎn)生的力能夠誘導(dǎo)或穩(wěn)定整合素激活構(gòu)象〔10〕。

3 踝蛋白-紐蛋白結(jié)構(gòu)在機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用

Talin是機(jī)械力感應(yīng)分子，而Vinculin是關(guān)鍵的機(jī)械效應(yīng)物之一。早期的結(jié)構(gòu)研究表明Talin與Vinculin的相互作用需要Talin中螺旋束的展開(kāi)，接著Vinculin與之前被掩蓋的紐蛋白結(jié)合位點(diǎn)(VBSs)結(jié)合〔11〕。分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)表明，在螺旋束兩端施加機(jī)械力可加速VBSs的暴露〔12〕。在細(xì)胞中，Vinculin存在活化和非活化兩種構(gòu)象。非活化時(shí)處于自我抑制狀態(tài)，首尾相接，在受到外力時(shí)，Talin和肌動(dòng)蛋白微絲分別與Vinculin的頭部(Vh)及尾部(Vt)功能域相結(jié)合，共同介導(dǎo)Vinculin的活化，使其向整合素募集，共同形成黏著斑，研究發(fā)現(xiàn)這種募集作用受到力學(xué)刺激的誘導(dǎo)〔13〕。Del等〔14〕在單分子實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在Talin N端施加大約12 pN的力，即可顯著增加Vinculin頭域與Talin的結(jié)合，提示力學(xué)刺激可誘導(dǎo)Vinculin的活化及其向黏著斑的募集。Ciobanasu等〔15〕發(fā)現(xiàn)，肌動(dòng)蛋白收縮時(shí)作用于Talin全長(zhǎng)的力增加了Talin與Vinculin的親和力。

4 踝蛋白-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)在機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用

Talin包含3個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合域(ABDs)。ABD1跨越FERM域的F2和F3子域；ABD2位于棒狀結(jié)構(gòu)域的中心，位于Talin蛋白的C末端〔16，17〕。成熟黏著斑的納米級(jí)組織顯示，Talin N端的ABD1位于細(xì)胞膜的近端，而ABD3則向細(xì)胞深處延伸以固定肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維〔18〕。在此構(gòu)象中，Talin作為機(jī)械傳感器，將機(jī)械力從肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架傳遞給黏著斑，這種特性使Talin能夠感受到ECM硬度〔19〕。實(shí)驗(yàn)表明〔14〕，Vinculin與VBSs結(jié)合后，肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)暴露，即Vinculin尾巴，從而加強(qiáng)了肌動(dòng)蛋白的錨定。

5 踝蛋白與AS

AS是一種高度復(fù)雜的疾病，其特征是進(jìn)展性的內(nèi)皮損傷、動(dòng)脈炎癥、血流動(dòng)力學(xué)改變和血管重構(gòu)，并導(dǎo)致斑塊形成、進(jìn)展和破裂〔20〕。一個(gè)多世紀(jì)前，Virchow提出血液流動(dòng)和停滯導(dǎo)致血栓形成的假說(shuō)，而在近50年前已提出血流動(dòng)力學(xué)改變影響AS發(fā)生的觀(guān)點(diǎn)。

5.1AS斑塊病理 AS斑塊內(nèi)含有的各種細(xì)胞中，血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)來(lái)源的細(xì)胞占70%左右，表明VSMCs增殖是AS斑塊形成的基礎(chǔ)〔21〕。VSMCs分為收縮型和合成型，二者間可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并受基因調(diào)控。胚胎發(fā)育時(shí)，VSMCs通過(guò)表達(dá)平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(SM α-actin)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)及鈣調(diào)節(jié)蛋白等收縮蛋白基因使細(xì)胞由合成型轉(zhuǎn)化為收縮型；當(dāng)細(xì)胞處于炎癥、應(yīng)激或應(yīng)力刺激等因素下，VSMCs通過(guò)下調(diào)上述基因表達(dá)，使細(xì)胞去分化轉(zhuǎn)化為合成型，獲得再增殖和分泌能力〔22〕。部分合成型VSMCs合成ECM并攝取脂質(zhì)變?yōu)榕菽?xì)胞，其余大量增殖，致使脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜增厚，成為AS的病理學(xué)基礎(chǔ)〔23〕。

5.2AS的血流動(dòng)力學(xué)機(jī)制 對(duì)AS病變部位進(jìn)行總結(jié)分析后發(fā)現(xiàn)，AS病變主要見(jiàn)于呈現(xiàn)異常切應(yīng)力模式的動(dòng)脈彎曲和分叉處，表明AS的發(fā)生與血流動(dòng)力學(xué)有因果關(guān)系，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)病灶分布和病理生理學(xué)改變與壁面剪切應(yīng)力有關(guān)〔24〕。低剪切應(yīng)力是AS形成公認(rèn)的危險(xiǎn)因素。孫濤等〔25〕根據(jù)流體力學(xué)原理，采用自行設(shè)計(jì)的楔形頸總動(dòng)脈套管植入兔頸總動(dòng)脈，發(fā)現(xiàn)低剪切力區(qū)域形成斑塊組織且其中脂質(zhì)成分增加、平滑肌細(xì)胞增殖，證明低剪切力可誘導(dǎo)AS的發(fā)生。低剪切應(yīng)力主要通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB及蛋白激酶(PK)Cξ等信號(hào)通路發(fā)揮作用，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生、增加脂質(zhì)攝取并增高內(nèi)皮滲透性，從而造成血管內(nèi)皮損傷，引發(fā)慢性動(dòng)脈炎癥、脂質(zhì)累積和氧化、內(nèi)膜增生和凋亡等病理過(guò)程，最終導(dǎo)致脂質(zhì)斑塊的發(fā)生發(fā)展〔26，27〕。剪切應(yīng)力反映血流對(duì)血管壁產(chǎn)生的切向摩擦力，與血液黏度和血流速度呈正比。目前，力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域認(rèn)為，機(jī)械應(yīng)力刺激首先激活細(xì)胞膜上機(jī)械感受器，包括整合素、受體酪氨酸激酶(RTK)、小G蛋白和離子通道等；然后通過(guò)分子構(gòu)象改變將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)，繼而激活下游信號(hào)通路，最終導(dǎo)致VSMCs細(xì)胞分化、增殖或凋亡等生物學(xué)效應(yīng)〔28〕。

5.3踝蛋白在AS中的表達(dá)及作用 Von等〔29〕通過(guò)微點(diǎn)陣分析和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析Talin-1、Talin-2基因在AS斑塊中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Talin基因在斑塊(頸動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈和股動(dòng)脈區(qū)域)中的表達(dá)與對(duì)照組相比均顯著且持續(xù)下調(diào)；通過(guò)免疫組化方法觀(guān)察到Talin基因在AS不穩(wěn)定斑塊中有進(jìn)一步下降的趨勢(shì)，表明Talin表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致組織對(duì)機(jī)械沖擊的耐受性降低且愈合能力受損，引起AS斑塊破裂，提示受損的組織機(jī)械穩(wěn)定性影響組織重塑和愈合能力，導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊形成。陳道運(yùn)〔30〕利用脈動(dòng)模式張應(yīng)力系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，在周期性應(yīng)變的作用下，Talin在VSMCs中表達(dá)逐漸增加且發(fā)生快速磷酸化，并應(yīng)用酪氨酸磷酸化抑制劑通過(guò)分級(jí)阻斷證明ECM-整合素-骨架蛋白-細(xì)胞骨架是周期性應(yīng)變促進(jìn)VSMCs增殖的重要信號(hào)通路。

綜上，Talin作為整合素/Talin介導(dǎo)的機(jī)械力轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中首個(gè)被證實(shí)能與整合素胞內(nèi)段結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白，可將來(lái)自ECM的機(jī)械應(yīng)力傳遞至細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)也將細(xì)胞骨架產(chǎn)生的牽引力傳遞至ECM。整合素/踝蛋白介導(dǎo)的機(jī)械感應(yīng)在生理狀態(tài)及包括癌癥、高血壓和纖維化在內(nèi)的多種疾病中都具有重要作用。一些公認(rèn)的抗腫瘤藥物可直接針對(duì)細(xì)胞中Talin的表達(dá)水平進(jìn)行靶向治療，如在前列腺癌和結(jié)腸癌中受到廣泛研究的白藜蘆醇，還有多沙唑嗪衍生物——DZ-50，兩者都被證明可以降低癌細(xì)胞中Talin的表達(dá)水平，表明Talin有望成為癌癥分子治療的新靶點(diǎn)〔31，32〕。