多柔比星納米遞藥系統在三陰性乳腺癌靶向治療中的應用

張敏娜，鐘 鳴，王光輝

(濟寧醫學院藥學院，山東 日照 276826)

高度惡性腫瘤三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)的生物學特點是腫瘤細胞雌激素受體(estrogen receptor,ER)陰性、孕激素受體(progesterone receptor,PR)陰性和人類表皮生長因素受體2(human epidemal growth factor receptor 2,HER2)陰性，腫瘤細胞的增殖不依賴于ER、PR和HER2，缺乏明確的藥物靶點，常規途徑給藥化療難以奏效，且不良反應嚴重[1]。多柔比星(Doxorubicin，Dox)通過干擾腫瘤細胞mRNA 和DNA的合成抑制腫瘤增殖。該藥對S期和M期腫瘤細胞作用尤為突出，屬廣譜周期非特異性抗腫瘤藥物(對乳腺癌、急性白血病、肉瘤、惡性淋巴瘤、肺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤均有作用)，在治療惡性腫瘤同時對正常組織細胞選擇性低，細胞毒性以造血系統毒性(骨髓抑制)和心臟毒性(心律失常、心肌損傷、心力衰竭等)最為突出。近年來研究發現，納米遞藥系統顯著改變化療藥物體內生物學特性[2]，尤其降低藥物的細胞毒性方面具有明顯優勢[3]。本文就近年來Dox納米遞藥系統在TNBC治療中的應用進行介紹，為TNBC治療提供參考。

1 納米材料獨特的生物學特性及在腫瘤診斷和治療中的應用

1976年Birrenbach等人首先提出了納米粒和納米囊的概念，1977年Couvreur等人發現納米顆粒能夠進入細胞，并具有溶酶體趨向性。1978年Kreuter等人用納米顆粒進行了疫苗載體的研究，1979年Couvreur等人用納米材料進行抗癌藥物載體的研究，90年代納米技術研究已成為醫藥領域的研究熱點之一。納米材料在醫學領域中應用包括生物熒光標記、病原體檢測、細胞及生物分子的分離純化、磁共振成像、靶向藥物/基因傳輸、腫瘤診斷和治療等方面[4]。納米材料主要通過其特有的粒徑效應(直徑在1～100 nm范圍)、表面效應(拉曼光譜散射)、量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應介導的超強吸附能力、化學反應能力、分散與團聚能力等發揮作用[5]。

具備靶向藥物/基因傳輸功能的納米遞藥系統應用廣泛，發展較為迅速，早期的納米遞藥系統結構簡單，通常以脂質體為載體，攜帶藥物進入體內，可減少被單核細胞吞噬清除的機會，藥動學監測顯示藥物在體內半衰期延長，藥效隨之增強。隨著納米遞藥系統研究的深入，納米材料參與靶向給藥方面取得了很大的成效，可實現負載藥物后到達病區進行集中釋放。近年來隨著納米技術的不斷發展和完善，納米載體攜帶藥物能有效克服細胞內環境屏障(如腫瘤病灶周圍的酸性環境屏障)、病灶區域滲透壓屏障等順利到達靶組織/靶細胞，實現藥物緩控釋放，增加了藥物的療效，減少了藥物的不良反應。納米技術引領藥物的遞送向智能化和可視化方向發展，實現了集紫外光激發光熱效應、磁力效應、化學效應與一體的藥物治療新策略，實現了智能化給藥和實時監測，為醫藥研究的新領域[6,7 ]。

近年來，在腫瘤治療方面，納米材料具有較好的組織相容性，通過腫瘤細胞過表達的分子，精準識別腫瘤組織，增加腫瘤細胞對化療藥物的攝取，激發光導熱消融作用殺死腫瘤細胞，有效遏制腫瘤的轉移和復發。納米材料表面的離子體共振波長可以隨長寬比變化，實現了從可見光區域到近紅外區域連續可調，形成極高的表面電場強度增強效應，極大的光學吸收和散射截面，用于腫瘤診斷、成像、精準治療和實時治療監測[8,9]。

2 多柔比星納米遞藥系統在TNBC中的應用

2.1 基于腫瘤酸性微環境的多柔比星體Dox納米遞藥系統腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME) 由腫瘤細胞外基質和酸性pH值、乏氧、間質液體壓力等因素組成，與腫瘤的增殖、分化和遷移密切相關。酸性微環境的形成源于缺氧條件下的腫瘤組織的無氧代謝，缺氧環境激活糖酵解，通過一系列產生酸的級聯生化反應形成[10]。pH 值敏感型納米遞藥系統通過pH 值敏感化學鍵(腙鍵、縮醛鍵、酯鍵、酰胺鍵、肟鍵等化學鍵)連接Dox，腫瘤酸性微環境中此鍵斷裂斷裂，釋放藥物，因此腫瘤組織藥物濃度高于正常組織。這種藥物傳遞系統顯著改變藥物的體內生物學特性，尤其在降低藥物的細胞毒性方面具有明顯優勢，增效減毒作用的發揮依賴于惡性腫瘤形成的酸性微環境，成為抗腫瘤治療的重要研究方向。

TME中酸性pH值和水解酶(蛋白)的過表達，為Dox靶向納米遞藥系統提供發揮作用的條件。基于pH反應的生物降解多聚谷氨酸(poly glutamic acid，PGA)的Dox納米遞藥系統Dox-PGA，PGA為 pH敏感性連接物，酸性環境促進了納米載體聚合物主鏈的特異性釋放Dox。TNBC小鼠模型經靜脈系統Dox-PGA給藥發現低劑量的Dox對原發腫瘤生長和肺轉移(降低90%)產生了明顯的抑制效果[11]。Dox-PGA遞藥系統可增加腫瘤細胞對Dox攝取，最大限度的減少正常細胞對Dox的攝取，保護正常組織。納米蛋白交聯聚合物籠(cross-linked polymer cage，CLPC)一方面借助腫瘤酸性微環境促發鏈接Dox的pH值敏感的腙鍵斷裂，在腫瘤局部釋放藥物形成高濃度Dox，進而發揮Dox的抑制和殺滅腫瘤效應；另一方面阻止正常細胞(pH約為7.40)對Dox攝取。更有意義的是CLPC進一步通過改變聚合物籠中交聯的程度調整納米載體表面電位，進而實現調控Dox納米載體的體內循環時間。動物模型實驗證實TNBC荷瘤小鼠對其耐受性良好， Dox血漿半衰期延長，內臟器官蓄積減少，細胞的毒性降低[12]。

酸性腫瘤微環境及過表達特定的酶蛋白(水解酶)、溫度和pH值構成了Dox釋放調節體系。魚精蛋白中螺旋/α-螺旋構象的改變以及蛋白質的酶解在酸性環境和溫度的配合下可有效的調控表面電荷轉化，增加腫瘤細胞對Dox的攝取量。魚精蛋白-PAA-b-PNIPAAm納米凝膠載體，對溫度、pH和酶等變化因素敏感，其作用機制與酶蛋白的構象調節有關。當pH由7.4下調到5.0過程中，通過酶蛋白的構象調節引起表面電荷轉化逐漸增強， TNBC MCF-7細胞株對Dox攝取明顯增加[13]。另外納米粒子可改變某些蛋白酶活性：將膠原酶I固定于納米顆粒(nanoparticles，NPs)表面，膠原酶酶活性明顯提高,有助于Dox穿越組織。 Amoozgar等[14]實驗證實NPs表面涂覆膠原酶I后降解腫瘤組織膠原蛋白能力增強，Dox的藥物穿透能力進一步增加；NPs蛋白質涂層降低了Dox的釋放速率，從而能夠持續緩慢釋放Dox，延長藥物作用時間，提高藥效。

2.2 組織相容性生物活性增加的多柔比星體Dox納米遞藥系統間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和納米磁性混合顆粒LDGI(LDGI由脂質體、Dox、金納米棒和氧化鐵納米團簇構成)構成的綜合性納米藥物遞送體系集合光聲成像、靶向熱療和藥物化療與一體，其最為突出的特點是LDGI具有良好的組織相容性，可有效地吸收到MSCs中，維持細胞功能。此外，LDGI中氧化鐵納米顆粒使MSCs表達趨化因子受體CXCR4上調，進一步易化與TNBC腫瘤細胞的識別,提高了腫瘤治療的靶向性。釋放的Dox進入細胞核增多，有效阻斷腫瘤DNA合成，且促進細胞凋亡。Xu等[15]體內實驗結果顯示，與單純LDGI相比，MSCs-LDGI通過腫瘤內注射和靜脈注射兩種途徑均能增強Dox在腫瘤組織分散能力和穿透腫瘤細胞的能力。納米遞藥系統與細胞膜之間的組織相容性還取決于腫瘤局部形成的滲透壓和藥物本身在腫瘤酸性微環境中是否帶有電荷等因素的影響，Dox作為一種可電離的弱堿藥物，正常情況下以不帶電的形式自由地滲透細胞膜，然而，在酸性TME中，Dox表面形成電荷，靜電斥力作用下跨膜過程受阻，由此克服靜電斥力構成的電荷屏障增加細胞相容性成為TNBC治療研究的另一個方向。Abumanhal等[16]應用靜脈注射碳酸氫鹽-脂質體-Dox對TNBC動物模型治療結果顯示，給藥在24 h后在腫瘤組織中檢測到的脂質體的含量為3.7%±0.3%，與注射游離非脂質體碳酸氫鹽的對照組(腫瘤組織的脂質體含量0.17%±0.04%)相比，腫瘤組織的脂質體含量提高了21倍。進一步檢測結果顯示，腫瘤內pH值達到7.38±0.04。以上研究結果證實碳酸氫鹽-脂質體-Dox給藥體系對TNBC的治療效果優于單純Dox給藥和碳酸氫鹽-Dox給藥。對TME的進一步分析發現碳酸氫鹽-脂質體-Dox給藥體系治療過程中T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞數量均增加，有效增強免疫系統對腫瘤的識別和應答能力。

Dox負載能力的提高對腫瘤細胞的抑制和殺滅具有決定性的意義。由近紅外熒光染料菁5.5(CY5.5)和細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)抗體硫醚橋聯的周期性介孔有機二氧化硅納米粒(periodic mesoporous organosilica，PMO)構成的Dox靶向遞藥系統PMO-CY5.5-ICAM具有良好生物組織相容性，Dox負載能力提高至400 mg·g-1，共聚焦顯微鏡顯示，Dox能有效靶向進入腫瘤細胞，導致腫瘤細胞死亡；體內實驗進一步證實Dox在TNBC移植腫瘤組織中累積量大于對照組，有效遏制腫瘤增殖[17]。

靶向納米遞藥系統增加組織相容性尚需突破其他的限制如藥物靶向分布、細胞內化速度、溶酶體逃逸受限和腫瘤耐藥性等因素。Alimoradi等[18]通過實驗研究聚苯乙烯馬來酸-叔十二烷S-亞硝基硫醇SMA-TDODSNO和 Dox聯合應用對TNBC腫瘤細胞增殖活力、細胞凋亡、線粒體膜電位、溶酶體膜通透性和腫瘤體積變化的影響。結果SMA-TDODSNO-Dox協同降低TNBC 4T1細胞株的細胞活力并誘導細胞凋亡。4T1細胞與SMA-TDODSNO-Dox(40 μmol·L-1)共孵育后，細胞吸收顯著增強，Dox濃度增加了2倍。SMA-TDODSNO單獨給藥可使腫瘤體積減少為單純Dox組的2倍；SMA-TDODSNO-Dox聯合應用可使腫瘤體積顯著減少為Dox組的4.7倍，實驗動物未見可監測的以體重減輕為標志的細胞毒性。

2.3 以腫瘤過表達的分子為靶點的納米遞藥系統盡管TNBC表達低或缺乏雌激素、孕酮或Her2/Neu受體，TNBC癌細胞由于生長、轉移或腫瘤耐藥性的需要，往往過表達一些分子，可作為腫瘤標志物進行檢測，為腫瘤診斷提供有價值參考信息。更重要的是這些分子中，上皮細胞粘附/激活分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、CD44受體分子、葉酸受體α(folate receptor α,FRα)、轉鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFR)等，可作為納米遞藥系統識別、穿越腫瘤細胞的重要靶分子。由靶向EpCAM的銀包覆金納米棒(AuNR/Ag)和負載Dox組成的靶向納米遞藥系統能夠特異性靶向EpCAM高表達的腫瘤。該系統對MDA-MB-231細胞的有效劑量(ED50)為3 μmol·L-1，對4T1細胞有效劑量(ED50)為110 μmol·L-1。電感耦合等離子體質譜分析結果顯示表達EpCAM的TNBC腫瘤細胞對Dox攝取速率增加[19]。

CD44受體在前列腺癌、膠質瘤和乳腺癌等多種腫瘤中表達增加，過度表達CD44受體的腫瘤往往預后不良。并且，CD44過表達已在許多不同的癌癥干細胞(cancer stem cells，CSCs)中被發現，它們存在于許多實體腫瘤中，并促進生長、復發和對傳統療法的耐藥性。TNBC中CSCs與腫瘤預后差、早期復發有關，這是因為CSCs具有較高的耐藥性和腫瘤異質性，是抗癌治療的主要靶點。包裹金NPs(AuNPs)聚合納米復合物(polymer nanocomposite，PNC)是由不穩定的酸腙鍵與硫代透明質酸偶聯的Dox和硫代聚乙二醇DNA CD44適配體共同組成的遞藥系統。研究發現，CD44陽性的TNBC細胞和CD44陰性TNBC細胞中相比，PNC的攝取量增加1倍，抑制腫瘤細胞增殖效果更明顯，腫瘤細胞更新能力下降，且 Dox的效能提高，非靶組織毒性有所減少[20]。

化療是乳腺癌治療的主要策略，缺乏特異性和化療藥物不良反應的高負擔仍然是乳腺癌患者成功治療的最重要障礙。高親和力FR跨膜轉運葉酸至細胞內部， 根據構成FR的糖多肽的不同分為四種亞型：FRα、FRβ、FRγ和FRδ。FRα為葉酸結合蛋白，以高親和力結合并將活性形式的葉酸單向轉運到細胞。FRα在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌和垂體腺瘤等腫瘤中高表達，與惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉移相關。β-乳球蛋白納米顆粒BNPs共軛葉酸和Dox構成遞藥系統FD-BNPs粒徑為(109.77±2.80) nm，具有良好的分散性和穿透細胞膜能力。包封率為68.82%±1.76%的FD-BNPs對乳腺癌細胞株(MCF-7和MDA-MB-231)的生長抑制作用和誘導細胞凋亡作用顯著。基于這些發現，FD-BNPs具有促進藥物釋放和靶向Dox遞送能力，對乳腺癌和TNBC具有較高的治療潛力[21]。

利用葉酸和/或轉鐵蛋白(transferring ，TF)對納米材料進行功能化，使藥物靶向傳遞更加精準有效，因為癌細胞過表達葉酸和TFR，可以介導攜帶藥物的納米遞藥系統的內吞作用。對金納米粒AuNPs經葉酸/TF配體修飾后的藥物載體，能夠更加精準靶向控制藥物的釋放，減少藥物的副作用，提高藥物的療效。Santiago 等[22]在實驗中將Dox加載到葉酸/TF配體修飾后的藥物載體，用超靈敏的表面增強拉曼散射光譜來監測跟蹤其受激釋放情況。研究結果證實AuNPs經葉酸/TF配體修飾后的藥物載體在不損傷正常細胞的前提下，對靶向癌細胞實現Dox高劑量給藥，同時實現了腫瘤治療的影像學監測。

3 總結與展望

綜上所述，多柔比星納米遞藥系統作為近年來TNBC治療的新策略，其優勢包括：(1)多柔比星納米遞藥系統在腫瘤酸性微環境中，實現了Dox緩釋效應和對腫瘤細胞的持續作用。(2)多柔比星納米遞藥系統組織相容性增加，一方面腫瘤細胞攝入Dox增加，加強化療藥物療效，另一方面正常細胞吸收減少，明顯減輕藥物的骨髓抑制和心臟毒性等細胞毒性不良反應。(3)納米材料所獨有的紫外線激發光熱效應殺滅各個時期腫瘤細胞、腫瘤干細胞和耐藥腫瘤細胞。(4)納米遞藥系統同時實現了免疫系統的激活和腫瘤治療的可視化監測。

當前納米遞藥系統存在的問題主要集中在納米材料的材質引發的組織器官的毒性反應，主要包括納米材料對線粒體、游離核糖體、粗面內質網、過氧化物酶體和細胞核等重要細胞器結構損傷和功能的抑制[23]。如納米銀顆粒在體內產生大量自由基導致組織和器官的氧化應激損傷[24]，進入肝細胞引發肝藥酶代謝活力降低導致代謝障礙，干擾轉錄因子NF-E2相關因子2所致的蛋白酶表達異常等[25]。除此之外，納米的組織特異性、對遞送條件的控制、載體的大小、生物分布率的限制等因素也會影響攜帶藥物藥效的發揮。隨著納米技術構筑的載體不斷完善，未來的納米遞藥系統結構上將會是集合高效性、低毒性和精準靶向性于一體，功能上實現納米載體同時攜帶化療藥物、腫瘤增殖抑制基因片段和免疫增強劑等綜合療法于一體，實現智能化給藥，通過多途徑、多靶點抑制和殺滅腫瘤細胞，為TNBC治療和研究帶來新的契機。