益生菌調控mTORC1信號通路干預骨質疏松的相關研究進展

尹晨飛，孫海飚，張子楠，馮志國，韓曉強

（1．山西醫科大學，山西 太原 030001；2．山西醫科大學第一臨床醫院，山西 太原 030001）

骨質疏松癥可增加患者骨折的風險，導致死亡率升高。盡管使用了諸多促進骨骼健康的治療方法，但是全球骨質疏松癥患者的數量仍在增加。傳統的藥物治療具有副作用，目前益生菌在治療骨質疏松方面表現出光明的前景，可以通過調控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1）信號通路干預骨質疏松。本文通過回顧近些年的相關研究結果，綜述骨、益生菌和mTORC1 之間的關系。

1 骨質疏松癥

骨質疏松癥是一個世界性難題，已經成為一種越來越常見的慢性骨骼疾病，全世界＞2 億患者受其影響[1]。其主要特征是骨密度和骨質量的進行性下降，以及骨微結構的破壞，這些改變導致了骨折的風險增加[2]。因此，骨質疏松癥的早期診斷、預防和治療都極為重要[3]。盡管已使用了諸多促進骨骼健康的治療方法，但全球骨質疏松癥患者的數量仍在增加。美國最新數據顯示，美國＞50 歲成年人中10.3%患有骨質疏松癥，43.9%成年人有骨量降低[4]。目前治療骨質疏松主要依賴傳統藥物，但是這些藥物并不總是有效，并且帶來了相當大的安全問題[5]。因此，尋找增加骨形成和維持骨強度的替代療法至關重要。

2 mTORC1 信號通路

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）是哺乳動物體內的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以形成mTORC1 和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2（mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2）。mTORC1 與mTORC2 的區別在于對雷帕霉素的不同敏感性：mTORC1 對雷帕霉素更敏感，它整合了多種細胞內和細胞外信號，包括Wnt、胰島素/胰島素樣生長因子-1、氧、能量、應激或氨基酸水平等信號分子，通過多種下游效應器調節細胞生長和代謝[6]。雷帕霉素是一種從土壤鏈球菌中提取的大環內酯類化合物，與相對分子質量為12 kD 的FK506結合蛋白具有高親和力，其形成的復合物可作用于mTOR，從而抑制mTORC1[7]。結節硬化蛋白復合物（tuberous sclerosis complex, TSC）是mTORC1 信號通路上游的一個關鍵調節器，包括TSC1 和TSC2 兩種形式，是一種鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate, GTP）酶激活蛋白，可以激活小G 蛋白Rheb 的GTP 酶活性，從而促進Rheb/GTP 結合態向Rheb/GDP 結合態轉化，TSC1/TSC2 磷酸化會抑制這種作用，從而導致胞質中Rheb/GTP 的聚集[8]；而Rheb/GTP 結合態會使mTORC1 發生磷酸化而激活[9]。mTORC1 的下游信號分子主要包括70 kD 的核糖體蛋白S6 激酶（ribosomal protein S6 kinase, P70S6K）、真核翻譯起始因子4E 結合蛋白1（eukaryotic initiation factor 4E binding protein 1, eIF4E-BP1）。活化的mTORC1 使eIF4E-BP1 和P70S6K 發生磷酸化，導致細胞內蛋白質、脂質生物合成增加，促進細胞分化增殖[10]。

3 研究現狀

目前許多實驗證實，益生菌治療骨質疏松有確切的療效[11-17]，但其干預骨質疏松的具體機制尚不十分明確，其是通過調節哪些信號分子的表達來發揮作用，以及這些信號分子如何影響成骨細胞和破骨細胞的活性都有待進一步的探索。mTORC1 普遍存在于人體細胞中，控制著許多細胞的生長過程，最近的研究也發現，mTORC1 與骨質疏松關系密切，已成為調節成骨細胞和破骨細胞生長與繁殖的主要效應物，而目前尚未發現mTORC2 有這種功能[9]。因此探索益生菌與mTORC1 的關系成為未來研究的一個主要方向。通過了解益生菌干預骨質疏松的mTORC1 信號通路將有助于人們制訂出更有效的治療策略。

4 益生菌干預骨質疏松的mTORC1 信號通路

4.1 益生菌通過IGF1-PI3K-mTORC1 信號通路調節成骨細胞活性

胰島素可以促進成骨細胞在細胞和分子水平的增殖和分化，從而促進新骨形成[18]。研究發現，給長期缺乏營養的小鼠喂養植物乳桿菌可以增加血清中的IGF1 水平[11]。IGF1 可作用于成骨細胞表面胰島素樣受體（insulin-like receptor, IR）激活IR 的酪氨酸激酶活性，活化的IR 通過磷酸化胰島素受體底物1（insulin receptor substrates, IRS1）使磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI-3K）激活，活化的PI-3K 可以催化細胞膜磷脂中的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate, PIP2）生成三磷酸磷脂酰肌醇，繼而招募磷脂酰肌醇依賴性激 酶1（phosphatidylinositol-dependent kinase, PDK1）和一種絲/蘇氨酸激酶-蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）形成二聚體，其中PDK1 可以使PKB 磷酸化而激活[19]。活化的PKB 使TSC1/TSC2 發生磷酸化致胞質中Rheb/GTP 聚集，從而激活mTORC1，促進成骨細胞增殖分化[9]。因此，益生菌可以通過上調體內IGF1的表達，激活成骨細胞中mTORC1 信號通路。

4.2 益生菌通過TNF-α/OPG-RANKLmTORC1 信號通路調節破骨細胞活性

破骨細胞來源于骨髓單核/巨噬細胞系造血祖細胞，其異常激活可以導致多種骨骼疾病，包括骨質疏松、骨關節炎及骨腫瘤等。研究發現，多種細胞因子可以促進破骨細胞的分化，其中核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factorκB ligand, RANKL）被證明是破骨細胞分化所必須的細胞因子[20]，其腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）超家族的成員，可作用于核因子κB 受體活化因 子（receptor activator of nuclear factor-κB, RANK），誘導單核/巨噬細胞系造血祖細胞形成破骨細胞[21]。RANKL 主要由成骨細胞和T 細胞分泌，RANK 主要表達于破骨細胞和樹突狀細胞[22]。研究發現，RANKL會激活破骨細胞中的mTORC1 信號通路，促進破骨細胞分化成熟[23]。其具體機制為：RANKL 與RANK 在破骨細胞上的結合會導致TNF 受體相關因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF）的募集而活化。TRAF 家族蛋白包括TRAF2、5、6，其中TRAF6 最重要（因為只有TRAF6 缺陷小鼠會出現骨質疏松癥），可以激活PKB 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）[24]，活化的PKB 和MAPK 分別促使TSC1/TSC2 復合物磷酸化，繼而引起細胞質中Rheb/GTP 聚集，促進mTORC1 活化，促進破骨細胞增殖分化[25]。研究發現，體內雌激素缺乏會導致RANKL 和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的表達增強，促進骨質疏松的發生[26]。BRITTON 等[12]用羅伊乳桿菌（lactobacillus reuteri, LR）喂養去卵巢（Ovariectomized, OVX）小鼠可以預防OVX 小鼠模型的骨丟失。通過對比LR 喂養的OVX 小鼠和未喂養的OVX 小鼠，發現LR 喂養的OVX 小鼠體內T 細胞和非T 細胞來源的RANKL 顯著減少。此外，DAR 等[13]進一步研究發現，用LR 喂養小鼠可以抑制其體內多種炎癥細胞因子的表達，包括白細胞介素-1（Interleukin-1, IL-1）、白細胞介素-6（Interleukin-, IL-6）、白細胞介素-7（Interleukin-7,IL-17）、TNF-α。而這些炎癥因子被證明可以上調成骨細胞中RANKL 的表達，從而導致破骨細胞分化成熟和骨吸收，其中TNF-α 發揮最主要的作用[27]。OHLSSON 等[14]研究也發現，用益生菌治療小鼠不僅降低了炎癥細胞因子TNF-α 和IL-1 的表達，而且增加了OVX 小鼠皮質骨中骨保護素（Osteoprotegerin,OPG）的表達。已知OPG 是腫瘤壞死因子受體（tumor necrotic factor receptor, TNFR）超家族成員之一，在許多組織中都有表達，如肺、心臟、腎臟和骨骼，可通過結合RANKL 防止破骨細胞中mTORC1 信號通路的激活，從而發揮骨保護作用[28]。因此，益生菌可通過減少炎癥因子（例如TNF-α 和IL-1）的表達和增加OPG 的表達，間接抑制RANKL 對破骨細胞mTORC1的活化，從而到達到干預骨質疏松的目的。

4.3 益生菌通過Wnt-GSK3-mTORC1 信號通路調節成骨細胞活性

在過去的幾十年中許多實驗證據表明，Wnt 信號對骨小梁和骨皮質的形成都至關重要。已知的Wnt信號通路包括Wnt 配體、單程跨膜脂蛋白受體相關蛋白（lipoprotein receptor-related protein, LRP）、七次跨膜受體卷曲蛋白（Frizled, FZD）。此外，細胞質中還存在一種異源四聚體破壞復合物，組成成分包括軸抑制蛋白、酪蛋白激酶1、腺瘤性息肉病蛋白、糖原合成激酶3（glycogen synthase kinase 3, GSK3）[29]。關于Wnt 信號通路，目前研究最深入的是其經典途徑——Wnt/β-連環蛋白信號傳導途徑，通過抑制轉錄因子β-連環蛋白的降解，達到促進細胞生長發育的目的。然而最近研究發現，Wnt 配體與FZD 和LRP的結合也能激活mTORC1 信號通路[30]。其具體機制為：當WNT 與LRP 和FZD 結合后，會招募Dishevelled 蛋白結合到FZD 的胞質尾部，導致破壞復合物的分解，從而抑制GSK3 活性，而GSK3 可以通過磷酸化TSC1/TSC2 復合物而抑制mTORC1 的激活，這一作用與Akt磷酸化TSC1/TSC2 復合物激活mTORC1 不同，因此Wnt 可以通過抑制GSK3 活性而激活mTORC1 信號通路，促進成骨細胞增殖分化[31]。Wnt10b 是公認的Wnt信號激活劑，屬于Wnt 的一種亞型。其過度表達會使成骨細胞數量增加，從而導致骨小梁過度形成。然而破骨細胞的數量和活性并沒改變，這表明Wnt10b 只作用于成骨細胞，增加骨形成[32]。KANG 等[33]研究也表明，Wnt10b 提高小梁骨質量是通過增加成骨細胞的數量而實現的，其對破骨細胞的數量和活性無影響。研究發現，給正常幼鼠補充鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnosus GG, LGG）會增加小鼠的小梁骨體積。進一步研究發現，這是由于LGG 可以引起骨髓和腸道中T 細胞數量增加，并導致其分泌的Wnt10b 增加[15]。ZHANG 等[16]的研究也證實，益生菌可以使1 型糖尿病患者體內成骨細胞中Wnt10b 表達增加。這些研究結果都表明益生菌可以上調成骨細胞中Wnt10b 表達，從而間接激活mTORC1 信號通路，促進成骨細胞增殖分化，達到干預骨質疏松的作用。由于Wnt 配體可以通過經典信號通路和mTORC1 兩種信號通路促進成骨細胞增殖分化，因此，關于具體是哪一種信號通路占據主導作用目前尚未可知，其具體機制還有待進一步研究。

4.4 益生菌通過BMP-c-Abl-PI3K- mTORC1 信號通路調節成骨細胞活性。

自從骨形態發生蛋白（the bone morphogenetic protein, BMP）在骨骼中被發現以來，BMP 已經被證明能夠刺激多種細胞培養系統中的成骨細胞分化。研究表明，BMP 可以激活mTORC1 從而增強成骨細胞分化過程中的蛋白合成能力[34]。雖然BMP2 可以通過誘導Wnt 的分泌來介導BMP2 的成骨功能[35]，但是BMP誘導成骨細胞蛋白的合成卻不依賴于這些新分泌的Wnt 因子，提示BMP2 激活mTORC1 的信號通路不同于Wnt 途徑[36]。研究發現，BMP2 在成骨細胞中可以激活酪氨酸激酶c-Abl，而用伊馬替尼抑制c-Abl 可阻止BMP2 誘導的PKB、eIF4E-BP1 和P70S6K 磷酸化，有效抑制BMP2 誘導的蛋白合成和與蛋白合成代謝相關基因的表達，該結果提示BMP2 通過c-Abl 激活mTORC1 信號通路。進一步研究發現，PKB 的上游信號分子是PI3K，eIF4E-BP1 和P70S6K 的上游信號分子是mTORC1。為進一步證實PI3K 和mTORC1 在介導BMP2 功能中的作用，又使用LY294002（一種PI3K抑制劑）抑制PI3K，發現完全抑制了BMP2 誘導的蛋白合成，也消除了BMP2 誘導的與蛋白合成代謝相關的基因的表達，使用mTORC1 抑制劑Torin1 也達到了相同的效果。因此，根據以上結果可以得出結論：BMP2 通過c-Abl 激活PI3K/PKB/mTORC1 信號通路，增加成骨細胞中蛋白合成，促進成骨細胞增殖分化[35]。研究發現，用益生菌（長雙歧桿菌）喂養OVX 大鼠，可以減少OVX 大鼠的骨吸收并且增加骨形成，增強OVX 大鼠的骨密度。進一步深入研究發現，該作用通過上調BMP-2基因實現[17]。因此，益生菌可以通過上調BMP-2基因的表達間接激活mTORC1 信號通路，促進成骨細胞增殖，干預骨質疏松。

5 總結與展望

骨質疏松癥可以引起各種骨骼的嚴重并發癥，對人們的生活質量有著深遠的影響。有必要制訂新的、安全、有效的策略來預防或治療由不同條件和變量（包括年齡、生物學性別、疾病、遺傳背景）引起的骨質疏松癥。近年來發表了多項關于益生菌干預骨質疏松的研究，表明口服益生菌可安全有效地預防各種情況下的骨質流失，顯示了益生菌對骨骼健康的潛在益處。然而，益生菌干預骨質疏松的機制十分復雜，目前尚未完全闡明，其可能的機制是通過調節IGF1、炎癥因子、Wnt 和BMP 的表達水平間接影響成骨細胞和破骨細胞的mTORC1 活性，但更具體的機制仍需進一步的實驗研究去闡明。相信未來通過研究益生菌干預骨質疏松的相關信號通路可以制訂出更加有效的治療策略。