PRMTs在腫瘤發生、發展中的作用及機制*

沈昊，張玲，劉修恒

（1.武漢大學人民醫院 泌尿外科，湖北 武漢 430060；2.荊州市中心醫院 病理科，湖北 荊州 434020）

細胞的正常生長依賴于控制細胞生長、分裂，以 及細胞分化、死亡多種基因的適當調節和相互作用。研究表明[1]，染色質修飾在調節細胞不同階段的生長和分化過程中發揮著核心作用，其中染色質的組蛋白修飾是基因轉錄、DNA 復制和修復等重要生物學過程的首要條件之一。組蛋白的N-端與DNA 接觸部分存在多種修飾方式，目前研究最多的是甲基化修飾。組蛋白的精氨酸甲基化修飾是染色質最重要的修飾方式之一，與許多細胞生理過程有關，包括信號轉導、轉錄調控、RNA 加工處理、DNA 重組和修復等[2]。蛋白精氨酸甲基轉移酶（protein arginine methyltransferases, PRMTs）是催化這種反應唯一的一類酶。PRMTs 具有催化多種細胞內蛋白質中特定精氨酸殘基甲基化的能力，通過將甲基從S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylme-thionine, SAM）轉移到目的蛋白質精氨酸殘基的胍基氮分子上，使之發生甲基化，從而調控特定蛋白質的生物學功能[3]。根據PRMTs 甲基化方式和蛋白序列的不同，PRMTs 的家族成員可以分為4種類型：Ⅰ型PRMTs（包括PRMT 1、2、3、4、6 和8）催化ω-NG 單甲基化和ω-NG、NG 不對稱雙甲基化，Ⅱ型PRMTs（包括PRMT5 和PRMT9）催化ω-NG 單甲基化和ω-NG、N’G 對稱雙甲基化，Ⅲ型PRMTs（包括PRMT7）只能催化單甲基化，Ⅳ型PRMTs 催化δ-NG 單甲基化（該酶的活性僅限于在酵母Rmt2 中）[3]。

PRMT5 又稱為Jak 結合蛋白1，是PRMTs 家族中最早鑒定出來的成員，其在腫瘤發生、發展中的作用被研究得最為深入。該蛋白是POLLACK 等[4]在酵母雙雜交系統中研究Janus tyrosine kinase 2 在細胞信號中的作用時篩選出來的蛋白。PRMT5 在所有真核生物中普遍表達，其催化域結構和功能從人類到細菌高度保守。PRMT5 具有許多重要的生理功能，例如核糖體和高爾基體的生物合成、細胞的增殖、凋亡和分化等[5]，能夠對稱性的雙甲基化某些蛋白質底物的精氨酸殘基，包括染色質的組蛋白、剪接體蛋白等[6]，在表觀遺傳學水平調控其他重要癌基因和抑癌基因的表達，如Cyclin D1、腫瘤抑制基因致瘤性抑制基因7（suppressor of tumorigenicity,ST7）、NM23、p53、PDCD4、E2F-1和E-cadherin等，參與多種細胞內的生物過程，調控細胞的生長增殖、凋亡及侵襲轉移過程，以及多個主要信號通路的調節?，F就PRMT5 在腫瘤的發生、發展過程中的作用及其機制進行綜述。

1 PRMT5 的結構和生物學功能

PRMT5 的結構在自然界中高度保守，無論是線蟲、非洲爪蟾還是人，PRMT5 都含有位于N-端的三聚磷酸異構酶（triosephophate isomerase, TIM）結構域，位于中間的Rossmann 折疊，以及位于C-端的SAM結合蛋白結構域[7]。PRMT5 的N-端TIM 結構域不僅可以與其他PRMT5 相互結合，形成PRMT5 的四聚體，而且可以與甲基轉移酶復合體蛋白50（Methylosome protein 50, MEP50）特異性結合。MEP50 是PRMT5 最常見的伴侶蛋白，與PRMT5 按1 ∶1 比例共同形成一個八聚體復合物，MEP50 可以增強PRMT5 對目的蛋白的選擇和識別能力，從而提高PRMT5 的甲基轉移酶活性[8]。PRMT5 作為表觀遺傳調節酶，通過與包括染色質結合蛋白、細胞器結構蛋白、信號轉導蛋白、受體蛋白等多種細胞內關鍵蛋白的相互作用，在維持細胞生長、胚胎發育、細胞分化等方面起著至關重要的作用，其異常表達，與腫瘤的發生、發展關系密切。

1.1 PRMT5 對組蛋白的甲基化作用

有研究發現[9]，PRMT5 通過與人SWI/SNF 染色質重塑復合物的結合，形成PRMT5/SWI/SNF 復合物，通過對稱性雙甲基化修飾多種腫瘤抑制因子和細胞周期調控基因啟動子區域的組蛋白H3 和H4，調控特定靶基因的轉錄。研究證實，PRMT5 通過催化組蛋白H3 精氨酸8（H3R8）和組蛋白H4 精氨酸3（H4R3）發生對稱性雙甲基化，能夠抑制多種腫瘤抑制基因的表達，如ST7、視網膜母細胞瘤（retin oblastoma, RB）腫瘤抑制基因家族和蛋白酪氨酸磷酸酶受體O 型（protein tyrosine phosphatase receptor-type O, PTPROt）等的表達[10]。在關于胃癌的隊列研究中[11]，證實PRMT5 在胃癌患者中高表達，并能協同增加胃癌細胞中腫瘤抑制基因1（iroquois homeobox 1,IRX1）啟動子區域的DNA 甲基轉移酶3A（DNA methyltransferase 3A, DNMT3A）的募集，當敲除胃癌細胞株中的PRMT5 后，可以顯著延緩胃癌細胞的生長并減少胃癌細胞的轉移，該研究還發現，無論過表達的PRMT5 是與核小體重塑復合物還是DNA 修飾酶發生相互作用，當沉默PRMT5的表達后，均能夠減少腫瘤的發生率并增加腫瘤細胞凋亡率。

在一項對結直腸癌中成纖維細胞衍生生長因子受體3（fibroblast-derved growth factor receptor-3, FGFR-3）和真核伸長起始因子4E（eukaryotic elongation initiation factor 4E, eIF4E）的研究中，發現PRMT5 誘導的H3R8和H4R3 對稱性雙甲基化可以提高FGFR-3和eIF4E基因的轉錄水平，當PRMT5 敲除后可以降低H3R8和H4R3 的甲基化水平，以及這2 個基因的表達[12]。同時，DENG 等[13]研究發現，PRMT5 可以激活前列腺癌細胞中雄激素受體（androgen receptor, AR）的表達，PRMT5 可以與轉錄因子BRG1 和SP1 相互結合，在AR基因的啟動子區域催化H4R3 發生對稱性的雙甲基化，導致AR的轉錄激活并增強前列腺癌細胞的生長。該研究還發現，PRMT5 的誘導性敲除是以AR依賴性的方式，即抑制AR 陽性前列腺癌細胞以及裸鼠皮下移植瘤的生長，并且使用PRMT5 的特異性抑制劑后，同樣可以降低H4R3 的甲基化水平，以及AR陽性前列腺癌細胞中AR 的表達，并延緩前列腺癌細胞的生長。

1.2 PRMT5 對非組蛋白的甲基化作用

PRMT5 除了具有甲基化組蛋白的能力，還能夠甲基化某些重要的轉錄因子，顯示出PRMT5 在細胞功能調控中的關鍵作用。PRMT5 可以甲基化p53并改變其DNA 結合活性，從而調控p53靶基因的表達[14]。PRMT5 也被證明可以甲基化N-MYC，改變其蛋白的穩定性，并增強 其在神經母細胞瘤中的致癌活性[15]。有研究表明[16]，在腫瘤發生、發展中起重要作用的轉錄因子E2F-1 和NF-κB/p65 同樣可以被PRMT5 修飾，該2 個轉錄因子一旦發生甲基化，可高效誘導靶基因表達。與此同時，PRMT5 的靶蛋白譜不僅僅局限于核轉錄因子，還包括細胞質蛋白，如高爾基蛋白、核糖體蛋白S10（ribosomal protein S10, RPS10）和快速加速纖維肉瘤（rapidly accelerated fibrosarcoma, RAF）蛋白激酶[5，17]。此外，研究進一步證實PRMT5 可以甲基化凋亡信號調節激酶1（apoptosis signalregulating kinase 1, ASK1）R89 處，并促進PRMT5 與蛋白激酶B（Akt）的結合[18]，發生對稱性甲基化的ASK1 與Akt 的相互作用導致其在絲氨酸83 處進一步磷酸化，從而減弱其活性并抑制細胞的凋亡。上述研究表明，PRMT5 除了能夠直接調控自身靶基因外，還能夠通過催化關鍵的核轉錄因子或細胞質蛋白發生對稱性雙甲基化，間接影響其他基因的表達，從而影響腫瘤細胞的生長、增殖和分化。

2 PRMT5 表達的調控機制

大量研究已經證實，PRMT5 在多種類型的侵襲性腫瘤中高表達，包括B 和T 細胞淋巴瘤[19]、轉移性黑色素瘤[20]、神經母細胞瘤和膠質母細胞瘤[21]、生殖細胞瘤[22]、卵巢癌[23]、乳腺癌等[24]。目前關于PRMT5在腫瘤組織中水平改變的機制研究較少，PAL 等[9]的研究表明，miR-92b 和miR-96 的下調是導致不同B 細胞淋巴瘤類型中PRMT5 mRNA 翻譯能力增強的原因。此外，在ALINARI 等[10]的研究中發現，PRMT5 可以與NF-κB/p65 和HDAC3 結合后形成復合物，該復合物與miR-96 啟動子區域結合并抑制其轉錄，從而通過負反饋回路調控miR-96 的轉錄，進而影響PRMT5 自身的表達。這些研究表明腫瘤組織中PRMT5 的高表達，是轉錄后失調的直接結果，并且PRMT5 可以通過直接抑制特定microRNA 的轉錄來促進自身的表達。

3 PRMT5 在腫瘤中的作用

3.1 腫瘤細胞轉化中的作用

細胞轉化是細胞發生遺傳性狀改變的一種變化，是腫瘤發生的重要原因之一。研究發現PRMT5 的高表達與腫瘤細胞轉化關系密切[10，19]。PRMT5 的高表達可以誘導體外永生化NIH3T3 成纖維細胞的轉化。研究發現，在細胞和動物水平上抑制PRMT5 的表達后，可以誘導癌細胞生長停滯和死亡[25]。ALINARI 等[10]的研究結果發現，正常B 淋巴細胞感染EBV 后，PRMT5蛋白水平最早在感染后4 ～8 d 升高，但是當誘導PRMT5 高表達后，miR-96 水平下降，PRMT5 直接靶基因（如ST7和PTPROt）水平下降，該研究結果不僅證實PRMT5 和miR-96 間存在負反饋回路的相關性，而且進一步證實PRMT5 與腫瘤細胞轉化相關。此外，研究發現[25]，PRMT5 的高表達與G1期細胞周期蛋白Cyclin D1、D2 和E1 的上調，以及細胞周期依賴性激酶（cyclin dependent kinases, CDKs）4 和6 有關，PRMT5 通過激活抑制促凋亡關鍵基因磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）和促進細胞存活關鍵基因Akt的表達，促進腫瘤細胞轉化，當使用PRMT5 的小分子抑制劑或shRNA 使PRMT5 沉默時，可以恢復miR-96 及其靶基因的表達水平。結果表明，PRMT5在控制細胞轉化中起著重要作用，其過度表達可以促進腫瘤細胞的轉化。

3.2 PRMT5 對腫瘤增殖信號通路的調節作用

PRMT5 在癌細胞中的高表達與腫瘤抑制基因的轉錄沉默高度相關[10]。同時有研究發現[26]，PRMT5可以通過高度保守的RB-E2F 途徑調控細胞生長，PRMT5 通過直接甲基化RB1、RBL1和RBL2等腫瘤抑制基因的啟動子區域的組蛋白H3R8 和H4R3 來調節這一途徑，對這些抑癌基因甲基化修飾的結果是3 個腫瘤抑制基因的轉錄受到抑制，然而，研究發現只有RBL2 在蛋白水平上被抑制，盡管RB1 和RBL1未被翻譯抑制，但是其都失去原本的蛋白活性，可能的機制是PRMT5 通過抑制miR-96 來促進Cyclin D-CDK4/6 的激活，RB1 和RBL1 被Cyclin D-CDK4/6激酶復合物的磷酸化而失活[19]。上述研究結果發現，在正常情況下，miR-96 通過抑制Cyclin D 的表達發揮抑制細胞生長的作用，而PRMT5 通過抑制miR-96 的轉錄來促進Cyclin D-CDK4/6 的激活。

有研究表明，PRMT5 通過甲基化修飾特異性精氨酸殘基來直接控制E2F 家族成員（如E2F1）的轉錄活性[27]，同時也間接通過調控腫瘤抑制因子Rb 家族的磷酸化水平和活性來控制其轉錄活性[19]。PRMT5 通過抑制腫瘤抑制蛋白Rb 家族的轉錄，導致E2F1靶基因PRC2亞單位的表達增加，以及PRC2甲基轉移酶活性增強，進而通過抑制抗癌基因的轉錄，包括促凋亡靶基因CASP10、DAP1、HOXA5和HRK，來促進癌細胞的生長和增殖[19]。根據結果，PRMT5 能夠通過對靶基因啟動子區域組蛋白H3R8 和H4R3 的甲基化，以及通過甲基化修飾包括E2F1 和NF-κB/p65 等關鍵轉錄因子的特異性精氨酸殘基來促進癌細胞的生長[24]。

有研究發現，PRMTs 雖然可以催化特定蛋白精氨酸的甲基化，但是PRMTs 家族不同成員可以賦予其靶蛋白不同的性質，比如PRMT1 和PRMT5 對E2F1 甲基化作用是互斥的。研究發現[27]，PRMT1 介導E2F1精氨酸109（R109）處發生不對稱雙甲基化能夠增強其轉錄活性，從而導致在DNA 損傷期間E2F1 促凋亡靶基因的表達增加，但Cyclin A 與E2F1 的結合可以阻礙PRMT1 與E2F1 的結合，并促進PRMT5 催化E2F1 在R111 和R113 處發生對稱性雙甲基化，發生雙甲基化的E2F1 與Tudor 結構域蛋白p100-TSN 結合，后者抑制其凋亡活性并增強其生長刺激功能。因此，根據E2F1 中發生的精氨酸修飾類型的不同，可以出現不同的結果，這進一步證實PRMT5 在防止細胞凋亡和促進細胞增殖中所起的作用。此外，LIM 等[28]通過實驗證實PRMT5 能夠增強癌基因（如C-MYC和Cyclin D1）的翻譯來控制細胞的增殖和存活，該研究表明，PRMT5 不僅可以通過調節eIF4E 的轉錄增加其蛋白水平，而且可以將eIF4E 招募到C-MYC和Cyclin D1mRNA 的5’帽結合區，以增強C-MYC和Cyclin D1的翻譯?？傊?，結果表明，PRMT5 通過控制關鍵細胞周期調節基因的轉錄、翻譯和翻譯后修飾促進腫瘤細胞的增殖。

3.3 PRMT5 對腫瘤關鍵蛋白穩定性的調節作用

轉錄因子Kruppel 樣因子4（Kruppel-like factor 4, KLF4）主要參與調控細胞命運和細胞周期的進展[24]，包括控制細胞增殖、維持基因組穩定、凋亡和干細胞更新，改變KLF4 穩定性將間接影響其下游的多個靶基因表達。PRMT5 能夠使KLF4 的R374、R376、R377 處發生甲基化，通過VHL/VBC E3 連接酶抑制KLF4 泛素化并增加其穩定性。研究表明[24]，在不同的乳腺癌細胞株中，PRMT5 的敲除或抑制導致KLF4泛素化和失活增加，證實PRMT5 在維持KLF4 蛋白穩定性中起關鍵作用。此外，該研究還發現，在乳腺癌細胞株MCF-7 中高表達PRMT5 或KLF4 會導致甲基化的KLF4 蛋白在細胞內積累，降低促凋亡基因BAX的轉錄，從而促進癌細胞生長和存活[24]。同時，乳腺癌基因芯片數據分析表明，在乳腺癌細胞株MCF-10A和MCF-7 中，KLF4 的表達升高可以上調一些癌基因和細胞周期激活因子的轉錄，如MAPK、EGF/EGFR、IGF1、Cyclin D2、CDK1和Cyclin E1，參與調節腫瘤干細胞更新和轉移的其他基因也在KLF4 過度表達的乳腺癌細胞中上調，包括C-MYC、SOX9、BMI1、Z1B1、SLUG、TWIST和N-Cadherin。更重要的是，對臨床樣本的分析表明，與鄰近的正常組織比較，高度侵襲性乳腺腫瘤組織中的PRMT5 和KLF4 細胞水平均升高。PRMT5 作為一種關鍵的表觀遺傳調控因子，通過精氨酸甲基化和泛素化之間的相互作用調節腫瘤干細胞關鍵轉錄因子的表達，能夠通過多種途徑促進腫瘤細胞生長和存活。

3.4 PRMT5 對腫瘤干細胞的調節作用

由于PRMT5 對胚胎和成人干細胞增殖和自我更新有重要影響，CHIANG 等[29]關于PRMT5 對腫瘤干細胞功能調節作用的研究發現，在乳腺癌干細胞（breast cancer stem cell, BCSC）中，PRMT5 的表達升高，當敲除PRMT5 后，BCSCs 的體外、體內增殖和自我更新顯著降低。此外，對NSG（NOD/Scid/IL-2Rγnull）小鼠接種PRMT5 敲除后BCSCs 的皮下移植瘤的組織病理學分析表明，與對照組比較，PRMT5 的表達降低可以出現分化程度更好和惰性的乳腺癌表型，結果提示PRMT5 對BCSC 的生長和增殖至關重要，靶向抑制PRMT5 可以減少乳腺癌干細胞的數量和抑制腫瘤的生長。同時，進一步研究PRMT5 和轉錄因子叉頭盒樣蛋白1（Forkhead box protein 1, FOXP1）之間的關系，發現PRMT5 通過對稱性雙甲基化H3R2 上調FOXP1 的表達，H3R2 是SET1/MLL 甲基轉移酶復合物WDR5 亞基的結合位點。當使用GSK591 抑制劑使PRMT5 失活，或者破壞WDR5 和SET1/MLL 復合物之間的相互作用，都可以導致H3K4 甲基化水平和FOXP1 表達顯著降低。該研究結果與FOXP1 基因敲除對乳腺癌細胞體外和異種移植生長的抑制作用結果是一致的，提示PRMT5 的某些促腫瘤特性是通過FOXP1 介導的，同時，進一步表明抑制PRMT5基因的表達是一種可行的治療腫瘤的方法。

3.5 PRMT5 對程序性細胞死亡蛋白的調節作用

研究表明[30]，程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death 4, PDCD4）是一種腫瘤抑制蛋白，在各種腫瘤中，其高表達水平與患者較高的生存率有關。在乳腺癌細胞株MCF-7 中，PRMT5 與PDCD4 相互結合后，PRMT5 將PDCD4 的R110 處甲基化，PDCD4 失去腫瘤抑制活性，該研究進一步發現，當2 種蛋白中的任何一種發生突變時，都會喪失對腫瘤的促進作用，這表明PRMT5 介導的PDCD4 甲基化對腫瘤的生長是至關重要的。此外，與PDCD4 水平高和PRMT5 水平低的患者相比，PRMT5 和PDCD4 表達水平均升高的患者生存率降低[30]。同時，在各種腫瘤中，已發現PRMT5 水平升高與患者的不良預后相關，在一項隨訪研究中，進一步證實PRMT5 與PDCD4 的這種相關性[31]，該研究發現，PDCD4 的甲基化促進營養缺乏時腫瘤細胞的存活，并且在PDCD4 磷酸化并轉移到細胞核后，該結果在營養恢復后被逆轉。以上這些研究表明，PRMT5 的過度表達導致其與促生長蛋白和腫瘤抑制蛋白相互作用發生改變，從而影響其生物學活性，有利于癌細胞的生長、存活和侵襲性。

3.6 PRMT5 對腫瘤代謝的調節作用

目前已知腫瘤細胞可以改變其代謝途徑，以促進其快速生長和增殖。PRMT5 除了能夠調控腫瘤細胞的增殖和死亡信號通路外，還參與腫瘤細胞脂肪生成的過程，以及高糖濃度下腫瘤細胞G1到S 期檢查點的調節。脂肪酸、甘油三酯和磷脂生物合成的基因表達過程受轉錄因子甾醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein, SREBP）1a 和c 的嚴格調控[32]，這2 種轉錄因子在Hek293 和HepG2 細胞系中均與PRMT5 發生相互作用，PRMT5 與腫瘤細胞脂肪生成增加具有相關性。這種相互作用依賴于PRMT5 的催化活性，PRMT5 對稱性雙甲基化SREBP1a 上的R321，阻止GSK3 對絲氨酸430 的磷酸化，增加其轉錄活性，從而促進肝癌細胞的脂肪生成[32]。PRMT5 介導的甲基化不僅可以阻止SREBP1a 的磷酸化，而且可通過蛋白酶體途徑抑制SREBP1a 的泛素化和降解。此外，SREBP1c 在HEK293 和HepG2 細胞系中均與PRMT5相互作用，并增強其穩定性，促進腫瘤細胞的脂質代謝和生長。PRMT5 通過穩定SREBP1a 或SREBP1c，在增加腫瘤細胞的脂肪生成中所起重要作用，并表明PRMT5 介導的SREBP 蛋白甲基化過程與肝癌的侵襲性之間有很強的相關性。

有研究表明，腫瘤細胞在轉化過程中是利用有氧糖酵解來產生細胞生存所必須的ATP，而不是通過常規的氧化磷酸化過程[33]。腫瘤細胞通過上調ATPase合酶中的ATPase 抑制因子1（ATPase inhibitory factor 1, ATPaseIF1）和下調ATPase 合酶的催化亞基β-F1 ATPase 來實現這種轉換。腫瘤細胞對葡萄糖的依賴伴隨著促進癌細胞生長的基因變化。研究表明，在高葡萄糖存在下，PRMT5 與細胞周期蛋白依賴激酶4（cyclin dependent kinase 4, CDK4）相互作用，并促進其從CDK抑制劑CDKN2a（p16ink4a）中釋放，從而促進肝癌細胞中的G1到S 期的轉變[34]。因此，PRMT5 通過甲基化組蛋白或非組蛋白，能夠調節對細胞存活和增殖至關重要的代謝途徑。

4 總結與展望

PRMT5 已成為多種癌癥的重要生物標志物，PRMT5 的致癌作用是由其甲基化組蛋白和非組蛋白的精氨酸實現的，導致下游癌基因和抑癌基因的表達失調，從而使細胞發生惡性轉化。越來越多的證據表明，PRMT5 的過表達可以激活增殖信號的轉導，促進癌細胞的生長和轉移，而抑制PRMT5 的活性或表達后，可以減緩腫瘤細胞的生長并重新激活抑癌基因的表達。由于必須要考慮到PRMT5 對正常發育和分化也是必不可少的，因此，盡管有理由開發行之有效的PRMT5 特異性抑制劑來治療各種類型的癌癥，但應在細胞和動物模型中進行嚴格的試驗，以排除PRMT5抑制可能對胚胎發生、精子發生、器官發育、成人造血和免疫反應等其他重要過程產生的不利影響。未來，通過應用高通量組學技術、新的細胞培養技術和條件性基因敲除動物，更有助于了解PRMT5 功能和在腫瘤發生、發展中的分子機制，可能會開發出對腫瘤預防和治療更有效的方法。