細胞毒T淋巴細胞抗原4基因多態性與肝癌易感性的相關性

趙斌 郭聯斌 段武瓊

肝細胞癌的致病因素包括環境、病毒感染、宿主腫瘤易感性等多種因素，而免疫力是影響宿主腫瘤易感性的重要因素。CD28分子與抗原遞呈細胞表面的B7家族分子(CD80與CD86)結合產生的共刺激信號對于活化原始T淋巴細胞起到關鍵作用，也是機體抗腫瘤免疫的重要環節[1]。近年研究發現[2]，T細胞活化會受到T細胞表面激活分子細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(Cytotoxie T lylnphoeyte assoeiated antigen-4，CTLA-4)的影響。基礎實驗發現[3]，CTLA-4可與抗原遞呈細胞表面的B7家族分子相結合從而協同抑制T細胞增生、活化，負性調節T細胞，使IL-2的產生與T淋巴細胞活化受到抑制。而CTLA-4與B7家族分子的結合力遠高于CD28，是CD28結合B7分子的競爭性拮抗劑。現有證據表明[4]，CTLA-4基因多態性具有重要生物學意義，對宮頸癌易感性[5]、變應性鼻炎[6]遺傳易感性等具有較大關聯，但目前有關CTLA-4與肝癌易感性的研究仍鮮有報道。本研究對比肝癌患者與健康體檢者的CTLA-4外顯子49位點的基因型分布，探討CTLA-4與肝癌易感性的相關性，現報道如下。

資料與方法

一、臨床資料

本院2016年1月—2018年12月共收治70例肝癌患者，均經組織活檢、CT或MRI查結合實驗室檢測確診為肝癌，其中男40例、女30例；年齡39～62歲，平均(52.42±7.67)歲。另選取同期于本院進行健康體檢的個體70例作為對照，男44例、女26例；年齡34～60歲，平均(50.81±8.20)歲。兩組均排除酒精性/藥物性肝病、自身免疫性肝損害、伴人類免疫缺陷病毒感染者。

二、方法

所有患者均進行CTLA-4多態性檢測：①提取外周血DNA：采用DNA提取試劑盒(購自北京科恩堡生物科技有限公司)提取外周血白細胞DNA，置于-20℃下保存。②聚合酶鏈(PCR)反應：引物序列49A/G，正向：5′-AATTGGGATTTA-GGAGGACC-3′，反向：′-AATACAGAGCCAGCCAAGCC-3′。擴增反應體系10 μL，反應條件：95℃下變性5 min，35個循環；95℃下變性30 s，在60℃、58℃、60℃下退火30 s。72℃延伸10 min。擴增片段為641和486 bp。③CTLA-4的49A/G位點多態性檢測：采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態法，使用限制性內切酶BbvI對擴增產物進行酶切，水浴24 h，取4 μL酶切產物，上樣于2%瓊脂糖，電泳分離(120 V、25 min)。對PCR產物進行測序。

三、觀察指標

比較2組的基因型分布(AA、AG、GG)及等位基因A、G頻率，采用Spearman相關性分析CTLA-4基因多態性與肝癌易感性的相關性。

四、統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計處理，計數資料的比較采取χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、基因型分布

兩組AA、AG、GG基因型的分布有統計學意義(P<0.01，表1)。

表1 兩組基因型分布的比較n(%)

二、等位基因頻率

肝癌組G等位基因頻率為71.43%(50/70)，顯著高于對照組51.43%(36/70)(χ2=5.909，P=0.015，P<0.05)。

三、相關性分析

Spearman相關性分析證實，CTLA-4基因多態性與肝癌易感性存在明顯相關性(r=0.701，P=0.012，P<0.05)，具體表現為攜帶G等位基因會增加肝癌患病風險，OR=4.101(2.227～10.031)。

討 論

CTLA-4基因的49位點A/G多態性已被證實與多種免疫性疾病有關，已有證據表明[7]，CTLA-4基因的49位點多態性會影響乙肝易感性，GG基因型攜帶者感染HBV風險明顯高于其他基因型攜帶者。鑒于以上，有專家推測[8]，CTLA-4基因的49位點的多態性也會影響肝癌易感性。

本研究將肝癌患者與健康對照者的CTLA-4基因的49位點基因型分布進行對比，發現2組的基因型分布存在顯著差異，具體表現為肝癌組以GG基因型最多見，而正常組則以AG基因型最多見，肝癌組G等位基因頻率為71.43%，高于對照組51.43%。相關性分析結果證實，CTLA-4基因多態性與肝癌易感性明顯相關，攜帶G等位基因患肝癌風險是攜帶A基因的4.101倍。目前研究顯示[9]，CTLA-4基因上存在6個多態性位點，其中外顯子1第17密碼子的49位點的單核苷酸多態性的生物學作用最廣泛。CTLA-4外顯子1區編碼49位點野生型為A等位基因，易突變為G等位基因，使該區編碼的蘇氨酸轉變為丙氨酸，引起蛋白質變性，使T細胞對CTLA-4分子相關蛋白的合成和表達減弱，造成T淋巴細胞表面的成熟CTLA-4分子減少，產生以下影響：①使T細胞活化周期停留在G0或G1期，不向S期進展，最終導致自身免疫性疾病或腫瘤的發生。②介導不依賴Fas途徑的T細胞凋亡，抑制T細胞分化與增殖，負性調節T淋巴細胞，下調抗腫瘤免疫功能。說明CTLA-4基因多態性主要是通過A等位基因突變為G等位基因而減弱機體抗腫瘤作用，增加肝癌發生風險，而攜帶A等位基因則是降低肝癌患病風險的有利因素。CTLA-4基因上其他位點如啟動子1722位點、啟動子1661位點對肝癌易感性的影響，本研究未能全部納入分析，為不足之處，有待后續補充報道。

綜上，CTLA-4基因的外顯子49位點基因多態性與肝癌易感性存在較大相關性，攜帶G等位基因的肝癌患病風險相對更大。