PD1/PD-L1信號通路相關蛋白在肝癌中的表達及與臨床病理特征的關系

李冰 云哲琳 董長城

研究發現，PD1/PD-L1信號通路主要作用于細胞的增殖和分化過程，由于腫瘤細胞的增殖及分化過程均有別于正常細胞，故該通路與多種腫瘤的發生和發展密切相關[1-3]。有研究發現PD1和PD-L1在胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤中存在高表達，其可能參與疾病發生和發展過程[4-6]。但關于PD1和PD-L1在肝癌中的表達及意義的研究鮮見。本研究對肝癌組織中PD1和PD-L1的表達水平進行分析，并探討其與病理特征間的相關性。

資料與方法

一、一般資料

選取2015年1月-2018年12月內蒙古包鋼醫院就診的80例肝癌患者作為研究對象。排除：排除標準為：合并重大惡性腫瘤者；合并精神疾病、心理疾病患者。其中男38例，女42例；年齡21～65歲，平均年齡(37.3±2.9)歲; 腫瘤直徑(0.4～6.8 cm)，平均腫瘤直徑(3.32 ± 0．22) cm。本研究獲得醫院倫理委員會批準，所有患者自愿簽署知情同意書。

二、方法

(一)RT-PCR檢測 PD1和PD-L1 mRNA的表達水平 提取總RNA，逆轉錄， SYBR green染料法進行定量，以GAPDH基因為內參。引物：(PD1-F: 5′-ATCTCACCGCTCGTTT-CCT-3′ ; PD1-R: 5′-CACTGCAAACCTCGGTGATG-3′; PD-L1-F: 5′-GGTA ATCCGTTTCCCTTGA-3′ ; PD-L1-R: 5′-CCTAATTTATGAGCC-TATC-3′ ; GAPDH-F: 5′-GGTAG-AACGTCCGTGTTTCA-3′ ; GAPDH-R: 5′-TTCAGTCCCA-GTCATGGAAC-3′)。

PCR反應程序:在98 ℃下進行30 s的預變性，接著在98 ℃下進行10 s的變性，再在50 ℃下進行30 s的退火，最后在72 ℃下進行45 s延伸，一共進行35個循環。

(二) Western blot檢測和PD1和PD-L1蛋白的表達水平 采用BCA試劑盒測定蛋白質含量，上樣20 μg，凝膠電泳，轉膜，封閉2 h，分別孵育PD1和PD-L1一抗，4℃過夜，洗膜，孵育二抗，顯影。

(三)免疫組化檢測PD1和PD-L1蛋白表達水平 所有腎透明細胞癌患者的腫瘤組織作為腎透明細胞癌組標本，其相應的臨近非腫瘤組織樣本(距離腫瘤組織2 cm以上)作為非腫瘤組織組標本。取病理石蠟標本，切片6張。用5%血清進行室溫封閉40 min后，加入1∶1 000的單克隆抗體4℃過夜孵育。隔天加入1∶1 000的二抗，在37℃孵育30 min，顯色，封片。拍照，收集數據并計算圖片中PD1和PD-L1蛋白表達的平均光密度。

三 統計學方法

實驗數據應用SPSS 17.0軟件進行統計分析。采用t檢驗分析2組間計量資料的比較。采用卡方檢驗分析兩組間計數資料的比較。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、 PD1和PD-L1 mRNA和蛋白表達水平結果

RT-PCR結果表明肝癌組PD1和PD-L1 mRNA表達水平較對照組均升高(P<0.05)。Western blot 結果表明肝癌組PD1和PD-L1蛋白表達水平較對照組升高(P<0.05)。見表1。

表1 PD1和PD-L1 mRNA表達水平灰度比值結果(±s)

注：與對照組比較，*P<0.05

二、免疫組化檢測PD1和PD-L1蛋白水平

采用免疫組化方法檢測組織中PD1和PD-L1表達陽性率，肝癌組PD1蛋白表達陽性率高于對照組(50.00%>31.25%)，差異有統計學意義(P<0.05)。肝癌組PD-L1蛋白表達陽性率高于對照組(72.50%>37.50%)，差異有統計學意義(P<0.05)。

三、 PD1和PD-L1表達與臨床病理因素的關系

統計分析證實PD1表達與肝癌患者腫瘤轉移密切相關，差異均有統計學意義(P均<0.05)。PD-L1表達與肝癌患者腫瘤直徑密切相關，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 PD1和PD-L1與患者臨床病理學特征關系分析

討 論

PD1/PD-L1信號通路與腫瘤細胞的增殖分化密切相關，PD1和PD-L1是一種與乳腺癌、結腸癌和胃癌等相關的腫瘤標志物[7-8]。Colette等[9]研究發現，PD1/PD-L1信號通路與胃癌的發生發展密切相關。Liu等[10]研究表明，與非腫瘤組織相比，乳腺癌腫瘤組織的PD1和PD-L1的基因，蛋白表達陽性率均升高。但關于PD1和PD-L1在肝癌中的表達及與臨床病理特征的關系研究較少。

本研究結果顯示，與非腫瘤組織相比，肝癌組PD1和PD-L1的基因，蛋白表達陽性率均升高，提示肝癌患者腫瘤組織中PD1和PD-L1高表達。統計分析證實PD1表達與肝癌患者腫瘤轉移密切相關，PD-L1表達與肝癌患者腫瘤直徑密切相關，結果提示PD1和PD-L1可以作為肝癌患者病情評估的標志物。

綜上所述，PD1和PD-L1在肝癌中表達顯著增高，且可能與肝癌發生、發展及預后相關，但還需要更多大樣本的臨床研究、前瞻性研究來驗證。