CD4+T淋巴細胞/Th17在原發性膽汁性膽管炎患者外周血單個核細胞中的表達及意義

張小玉 張紅梅 王雷 臧志棟

原發性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一種自身免疫介導的慢性膽汁淤積性肝病，臨床表現以血清抗線粒體抗體(AMA)陽性、IgM升高，組織病理學特征表現為小葉間膽管為中心的炎性細胞浸潤、小膽管增生以及膽汁淤積，可慢性進展至肝纖維化，最終導致肝硬化。由于PBC 患者在發病初期缺乏明顯的臨床表現，大多數病人確診時已到了病程晚期，治療非常困難, 且PBC在我國的發病率呈逐年上升趨勢，由此研究PBC的病因和發病機制，具有十分重要的意義[1]。

CD4+T淋巴細胞在PBC的致病過程中發揮著重要作用, 在不同細胞因子的刺激下可分化為不同亞群，包括輔助性T淋巴細胞Th1、Th2、Thl7及調節性T淋巴細胞(Treg) 等[2]，Th17是新發現的一種CD4+T淋巴細胞亞型，以分泌 IL-17為特征，在自身免疫性疾病中扮演著十分重要的角色[3]。 研究表明 Thl7細胞的分化與多種細胞因子密切相關，特別是IL-22、和IL-23等在誘導時起到了十分重要的作用[4]。本項目是研究CD4+T淋巴細胞/ Th17在原發性膽汁性膽管炎患者外周血單個核細胞中的表達，以初步探討Thl7等細胞因子與PBC疾病的發生及疾病分期以及發展的關系。

資料與方法

一、病例選擇

選擇病例來自2018 年 7 月至 2019 年 7 月在南京市第二醫院(南京市中醫藥大學附屬南京醫院)收治的患者，共24 例，其中女性 20例,男性 4 例，年齡35～60歲，平均年齡48.32歲。根據2009年美國肝病學會診斷標準和歐洲肝病學會診斷標準，診斷 PBC 需符合下列 3項診斷標準中的兩項：(1)血清抗線粒體抗體(AMA)陽性；(2)血清堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)和(或)谷氨酰轉肽酶(gamma-glutamyltransferase，GGT)水平升高；(3)肝臟典型病理改變。所有患者均排除了病毒性肝炎及藥物性肝病等慢性肝臟疾病，同時征得病人本人同意后，簽署知情同意書，所有患者給與肝穿刺活檢，在腹部彩超的引導下行肝臟穿刺活檢術，采用統一標準閱片，根據 Scheuer 評分系統對標本進行病理分期：Ⅰ期為小膽管炎期，Ⅱ期為細小膽管增生期，Ⅲ期為瘢痕期，Ⅳ期為肝硬化期。選取同期肝血管瘤切除標本的遠端正常肝組織作為正常對照組，男性13例，女性11例，年齡32～60歲，平均年齡52.25歲，兩組人員具有可比性。固定肝穿組織分別送南京中醫藥大學附屬南京醫院病理教研室一份，另一份南京中醫藥大學附屬南京醫院肝病研究所。

二、研究方法

(一)抽取研究對象外周靜脈血5 mL，采用統一方法利用流式細胞儀檢測患者血CD4+T淋巴細胞/ Th17細胞比值，血生化檢測研究對象的肝功能，檢測ALP、GGT等的數值。

(二)外周血單個核細胞的分離與培養：抽取患者外周靜脈血5 mL，PBS稀釋后，以血：Ficoll為1∶2的比例將血標本緩慢加入到Ficoll試劑中，400 g，離心30 min，吸取白色薄膜層到新的離心管中，用PBS洗兩次后重懸計數。將分離的PBMC置于含有10 mL/dL FBS的1640培養基中培養24 h，不加刺激，收集上清進行細胞因子測定。

(三)細胞因子檢測采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)檢測樣本血清中IL-23、IL-17的表達水平。ELISA試劑盒購自中國上海Arigo公司。實驗操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

三、統計學處理

結 果

一、PBC組與對照組外周血及肝組織中 CD4+T淋巴細胞/ Th17的比較

表1顯示，與HC組比較，PBC組外周血、肝組織中CD4+T淋巴細胞/ Th17值表達量明顯高于HC組(P<0.05)，差異有統計學意義。

表1 PBC組與對照組肝組織中 CD4+T

與HC組比較，▲P<0.05

二、PBC組與對照組Th17 、IL-17、IL-23、等細胞因子濃度的比較

表2顯示，與HC組比較，PBC組的Th17 、IL-17、IL-23、水平顯著增高(P<0.05)，差異有統計學意義；與HC組比較， TGF-β表達水平也增高，差異有統計學意義(P<0.05)；

三、Th17 、IL-17、IL-23、TGF-β水平與ALT、TBil、GGT、ALP、AST的比較

血清Thl7相關細胞因子水平與各項臨床及實驗室指標的相關性分析如表3所示，與ALT、Tbil、GGT、ALP、AST、呈正相關(P<0.05)，差異有統計學意義。

四、CD4+T淋巴細胞/Th17及IL-17在PBC Ⅰ-Ⅱ期和PBCⅢ-Ⅳ期中的比較

PBC患者PBCⅢ-Ⅳ期肝組織和外周血中CD4+T淋巴細胞/ Th17數值明顯比PBC Ⅰ-Ⅱ期值升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且IL-17表達在PBC Ⅰ-Ⅱ期和PBCⅢ-Ⅳ期血清量差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表2 各組血清CD4+T相關細胞因子水平比較(±s)

與HC組比較，▲P<0.05

表3 各組血清Thl7相關細胞因子水平與臨床及實驗室指標相關性分析

▲：P<0.05：▲▲：P<0.01

表4 PBC Ⅰ-Ⅱ期和PBC Ⅲ-Ⅳ期2組間比較(±s)

討 論

原發性膽汁性膽管炎(primary biliary choloangitis,PBC )是一種以肝臟為相對特異性免疫病理損傷器官的自身免疫性疾病，全球范圍內40歲以上的女性發病率約為1/1 000，我國的流行病學調查結果表明，中年女性的發病率為155.8/10萬[1],。PBC病理特點為進行性、非化膿性肝內小膽管炎，以瘙癢、黃疸為主要表現，到疾病晚期可產生腹水、消化道出血及肝性腦病、最后發展為肝衰竭。臨床上90%～95%的PBC患者血清中可以檢測出高滴度的抗線粒體抗體(AMA)， PBC發病機制至今尚未完全闡明，Harada等應用病原相關分子模式(PAMP)刺激膽管上皮細胞發現也能夠產生Thl7誘導因子(IL-6、IL-1B、IL-23)[6-7]。最近一項研究：敲除IL-17A的小鼠膽管損害減輕、AMA抗體和IFN水平顯著降低；敲除IL-22的PBC小鼠也出現了膽管損害減輕和IFN水平下降。另外，在PBC小鼠模型中IL-23/Thl7通路也促進了IL-12/IFN介導的免疫病理損傷過程[8-9]。

本研究表明PBC患者的肝組織和血清中CD4+T淋巴細胞/ Th17及細胞活化因子IL-17、IL-23水平與健康人群相比均顯著升高，通過相關性分析，我們的研究表明PBC患者的ALP、GGT、IgG表達量明顯提高，各血漿細胞因子IL-17、IL-23表達量與各項臨床及實驗室指標ALT、TBil、GGT、ALP、AST、呈正相關(P<0.05)，差異有統計學意義。外周血及肝組織中CD4+T淋巴細胞/ Th17及IL-17在PBC Ⅲ-Ⅳ期中的數值明顯高于PBC I-Ⅱ期，差異有統計學意義(P<0.05)，這與眾多的研究結果一致[10]，反映出PBC患者存在膽汁淤積、膽管堵塞以及不同程度的肝細胞損傷和肝功能下降的情況。表明CD4+T淋巴細胞尤其是輔助性T淋巴細胞Thl7參與了PBC的炎癥反應過程，可能在PBC疾病過程中發揮了重要作用。

我們的研究結果提示PBC患者受損的門管區及外周血中存在大量的CD4+T淋巴細胞浸潤，CD4+T淋巴細胞/ Th17、IL-17在PBC的發生過程中具有重要作用，CD4+T細胞的異常活化和增殖在PBC發病過程中起了十分重要的作用，參與其細胞因子介導的伴有AMA形成的自身免疫過程，我們期待在通過對PBC發生發展機制的研究過程中通過復雜的免疫學調控網絡找到更多的方向和證據，為臨床患者帶來希望和健康保障。