酸馬奶源產細菌素植物乳桿菌MXG-68的益生特性

滿麗莉，向殿軍，李華，倪娜

（內蒙古民族大學a.生命科學學院，b.農學院，內蒙古通遼，028042）

0 引 言

益生菌是能促進宿主健康的活體微生物，具有無殘留、無毒副作用、無抗藥性、耐酸堿、耐膽鹽等優點，是未來替代抗生素的潛在產品[1-2]。乳酸菌菌株是作為益生菌的最常見微生物，目前商業化產品中使用的益生菌大部分屬于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，大多數是人體來源或乳及乳制品來源的、具有免疫調節功能、能在胃腸道中存活的微生物[3-4]。目前篩選具有良好益生特性、壓力耐受性及自主知識產權的益生菌是研究的熱點之一。

植物乳桿菌是發酵食品中常見的乳酸菌，因其來源安全（GRAS）被廣泛用于益生菌的篩選，其對黃瓜、橄欖、酸菜、發酵乳制品等發酵食品的高酸度和高鹽環境具有強耐受性，因而在食品工業中應用甚廣[5-6]。另一方面，植物乳桿菌對極端的胃腸道環境（胃酸、膽鹽）有足夠的抵抗力。此外，一些菌株還具有其他的益生菌特性，包括較高的β-半乳糖苷酶活性和疏水性，這與菌株對宿主的黏附能力有關；抑菌物質的產生如：細菌素、過氧化氫、酸性物質等，這與菌株抑制致病性微生物、維持腸道菌群平衡、提高腸道免疫力有關[7-9]。

FAO/WHO的標準認定益生菌篩選必須滿足三個基本特點：耐受胃腸黏膜的選擇環境、黏附宿主的腸壁細胞、分泌物或者分解產物為抗菌物質[10]。本試驗通過評價酸馬奶源產細菌素植物乳桿菌MXG-68的益生性能，以期為益生菌的開發提供新的菌種資源，為進一步開發微生態制劑及其工業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品及模式菌株

植物乳桿菌MXG-68分離于內蒙古地區的酸馬奶中，由實驗室自行保存。指示菌菌株購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 試劑、培養基及主要儀器設備

1.1.2.1 試劑、培養基

乳酸菌及指示菌所需培養基購自英國Oxoid公司；過氧化氫酶、異硫氰酸熒光素購自美國Sigma公司；抗菌藥物紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司及北京天壇藥物生物技術開發公司；Caco-2細胞、胎牛血清購自以色列BI公司；DMEM培養基購自上海英駿生物技術公司；其它藥品均為國產分析純或化學純。

1.1.2.2 主要儀器設備

J-54A/MJ-78A型STIK滅菌鍋：北京天賜科儀商貿有限公司；Microfuge16型離心機：美國貝克曼公司；110-801型三量ip67防水原點數顯卡尺不銹鋼零點電子游標尺：東莞市景有模具五金有限公司；DHP-600恒溫培養箱：常州中捷實驗儀器制造有限公司；Model 680型酶聯免疫檢測儀：美國Bio-Rad公司；DNP-9272型生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

植物乳桿菌MXG-68的培養方法：挑取菌株接種于裝有100 mL MRS培養基（p H 5.8）的250 mL錐形瓶中，37℃培養至約109cfu/mL。

指示菌的培養方法：挑取指示菌接種于裝有100 mL培養基的250 mL錐形瓶中，37℃培養至約107cfu/mL。產氣莢膜梭菌及生孢梭菌用RCM培養基；單核細胞增生李斯特氏菌用TSA-YE培養基；糞腸球菌、銅綠假單胞菌及腸炎沙門氏菌用LB培養基；其他指示菌均用NB培養基。

1.2.2 植物乳桿菌MXG-68的抑菌特性試驗

1.2.2.1 抑菌譜的測定

按1.2.1的方法獲得植物乳桿菌MXG-68的菌液按1%接種于裝有100 mL MRS培養基（p H 5.8）的250 mL錐形瓶中，30℃發酵24 h。

無細胞發酵上清液的制備及抑菌活性測定：發酵液經12 000×g，于4℃離心10 min，收集上清液，用1 mol/L NaOH調p H值至7.0，排除有機酸的干擾。加入過氧化氫酶（終濃度為5.0 mg/m L），37℃水浴2 h排除過氧化氫的干擾，上清液經0.22μm濾膜過濾后備用，取50μL上清液測定抑菌活性。植物乳桿菌MXG-68所產細菌素對20株指示菌的抑菌活性采用雙層平板打孔法檢測[11]，打孔直徑為6 mm，抑菌圈直徑采用電子游標卡尺測定。

1.2.2.2 傳代穩定性的測定

將植物乳桿菌MXG-68在MRS培養基斜面上連續傳代20次，培養溫度為37℃，培養時間為24 h。將不同代次的菌株按照1.2.1和1.2.2.1的方法培養并制備無細胞發酵上清液，以鼠傷寒沙門氏桿菌ATCC14028為指示菌，通過雙層平板打孔法檢測觀察不同代次菌種抑菌活性的變化情況，確定植物乳桿菌MXG-68所產細菌素的傳代穩定性。

1.2.3 植物乳桿菌MXG-68的動力學曲線測定

按1.2.1的方法獲得植物乳桿菌MXG-68的菌液按1%接種于裝有100 mL MRS培養基（pH 5.8）的250 mL錐形瓶中，30℃發酵32 h，每隔2 h取樣，通過平板菌落計數法測定樣品的活菌數，獲得菌株的生長曲線。按照1.2.2.1的方法制備樣品的無細胞發酵上清液，以鼠傷寒沙門氏桿菌ATCC14028為指示菌，通過雙層平板打孔法測定抑菌活性，獲得菌株所產細菌素的發酵曲線。

1.2.4 植物乳桿菌MXG-68對人工胃液的耐受性試驗

人工胃液的制備：取10 g胃蛋白酶，2 gNaCl，7 mL濃鹽酸，加蒸餾水至約800 mL，搖勻定容至1 000 mL。用HCl分別將100 m L人工胃液的pH調至1.0～4.0，0.22μm濾膜過濾除菌。按1.2.1的方法培養的植物乳桿菌MXG-68菌液按5%接種于不同p H的人工胃液中，處理1～4 h。經適當稀釋后，運用平板菌落計數法分析菌株對人工胃液的耐受性。存活率（%）=（處理后的活菌數/處理前的活菌數）×100%。

1.2.5 植物乳桿菌MXG-68對人工腸液和膽鹽的耐受性試驗

人工腸液的制備：500 m L蒸餾水溶解6.8 g KH2PO4，調p H至6.8，加入10 g胰蛋白酶，定容至1 000 mL。100 mL人工腸液中分別加入0.1～0.4 g膽鹽（終濃度為0.1%～0.4%），0.22μm濾膜過濾除菌。按1.2.1的方法培養的植物乳桿菌MXG-68菌液按5%接種于含有不同濃度膽鹽的人工腸液中，處理1～4 h。經適當稀釋后，運用平板菌落計數法分析菌株對人工腸液和膽鹽的耐受性。存活率（%）=（處理后的活菌數/處理前的活菌數）×100%。

1.2.6 植物乳桿菌MXG-68對Caco-2細胞的黏附性試驗

菌液制備：按1.2.1的方法培養的植物乳桿菌MXG-68菌液于4℃，8 000×g離心15 min，棄上清后菌體用無菌的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，用無菌的磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體至108cfu/m L，備用。

植物乳桿菌MXG-68的熒光標記：制備的菌液懸浮于100mg/mL異硫氰酸熒光素中，于37℃避光處理1h，用無菌的磷酸鹽緩沖溶液洗滌后重懸菌體至108cfu/mL，備用。

Caco-2細胞的培養：Caco-2細胞在裝有DEME細胞培養液（含10%的熱滅活胎牛血清、100μg/mL鏈霉素及100IU/mL青霉素）的無菌細胞培養瓶中，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。

黏附試驗：取熒光標記的植物乳桿菌MXG-68與Caco-2細胞培養液等體積混勻，以不加菌液的細胞培養液為對照。培養板于CO2恒溫培養箱中37℃孵育1h，用無菌的磷酸鹽緩沖溶液洗脫未黏附的菌體。加入0.1mL的胰酶，待細胞完全脫落后加入0.4mL完全培養液終止反應，用酶標儀測定細胞懸液的熒光強度，發射光和吸收光波長分別為530nm和485nm。細菌的黏附率（%）=（乳酸菌黏附Caco-2細胞并洗脫后細胞懸液的相對熒光強度/乳酸菌黏附Caco-2細胞前的相對熒光強度）×100%。

1.2.7 抗菌藥物的敏感性試驗

采用濾紙片法檢測植物乳桿菌MXG-68的藥敏性，具體操作如下：按1.2.1的方法培養的植物乳桿菌MXG-68菌液均勻涂布于MRS培養基上，靜置晾干。用已滅菌的鑷子取40種抗菌藥物紙片貼于已均勻涂布菌液的MRS培養基表面，37℃培養24h，測定抑菌圈直徑。

1.2.8 數據分析

所有的測定數據均重復三次，應用SPSS17.0軟件中的One-wayanalysisofvariance（ANOVA）計算標準差。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌MXG-68的抑菌特性

2.1.1 抑菌譜

由表1和圖1可知，植物乳桿菌MXG-68所產的細菌素對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑制作用，是一種廣譜細菌素。且發現其對同種指示菌（如金黃色葡萄球菌ATCC12600和PTCC1112，鼠傷寒 沙 門 氏 桿 菌 ATCC13311、CGMCC1.1552和ATCC14028）的抑菌效果亦不同，可能是由于指示菌本身的差異所造成的。目前已報道的可同時抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的植物乳桿菌并不多，如植物乳桿菌KLDS1.0391、植物乳桿菌LD4和植物乳桿菌KL-1等[12-14]。作為有利于人及動物健康的益生菌，能夠產生抗菌物質才能更好地抑制腸道中致病性微生物的生長，減少有害物質的產生，近而提高腸道免疫力及維持腸道菌群平衡。植物乳桿菌MXG-68能夠產生廣譜細菌素，滿足成為益生菌的基本條件之一。

2.1.2 傳代穩定性

各代菌株所產細菌素的抑菌活性之間的差異不顯著（P＞0.05），表現出穩定的遺傳特性，其細菌素生產性能基本保持穩定,如圖2所示。說明細菌素生產菌株-植物乳桿菌MXG-68具備作為工業生產細菌素出發菌株的前提條件。

表1 植物乳桿菌MXG-68的抑菌活性

圖1 植物乳桿菌MXG-68所產細菌素抑菌圈

2.2 植物乳桿菌MXG-68的動力學曲線

圖2 植物乳桿菌MXG-68抑菌活性的傳代穩定性

圖3 植物乳桿菌MXG-68的生長曲線及發酵曲線

由圖3可知，植物乳桿菌MXG-68呈現典型的S型生長曲線，經歷一個短暫的延滯期（0～4h），4～14h為對數生長期，14h進入穩定期，24h達到最大生長量。細菌素的合成遵循其生長模型，細菌素合成開始于4 h，在穩定期中部（24 h）達到最大合成量，抗菌活性在4～24 h呈現快速上升趨勢，24～32 h呈現緩慢下降趨勢。與植物乳桿菌P158相比，植物乳桿菌MXG-68的延滯期較短，菌種活力強，達到最大生長量（提前12 h）和細菌素合成量（提前16 h）的時間短，能有效地提高設備的利用率，適合于工業化應用[15]。

2.3 對人工胃液的耐受性

對人工胃液的耐受性是確保菌株在宿主體內生長和存活的前提，亦是作為益生菌制劑的先決條件。人體及動物胃液的p H一般為1～2，食物在胃中的排空時間一般為4 h，根據此設計植物乳桿菌MXG-68對人工胃液的耐受性試驗[16-18]。由圖4可知，同一pH條件下，隨著培養時間的延長，植物乳桿菌MXG-68的存活率呈現下降趨勢。而在同一處理時間內，隨著p H的增加，存活率呈現上升的趨勢。p H=1的存活率顯著低于p H=2～4時的存活率（P＜0.01）。所有處理組的存活率均達到47.91%以上，說明植物乳桿菌MXG-68對胃液的耐受性較強。與張開屏的研究結果相類似[19]。

2.4 對人工腸液和膽鹽的耐受性

益生菌對腸液及膽鹽具有較高的耐受性是發揮益生作用的必要條件，腸液為堿性，p H值一般約為7.6，且正常小腸的膽鹽含量為0.03%～0.3%，食物在小腸中的停留時間一般為1～4 h，根據此設計植物乳桿菌MXG-68對人工腸液和膽鹽的耐受性試驗[20-21]。

圖4 不同pH的人工胃液對植物乳桿菌MXG-68存活率的影響

圖5 不同膽鹽濃度的人工腸液對植物乳桿菌MXG-68存活率的影響

由圖5可知，人工腸液和膽鹽會導致植物乳桿菌MXG-68的存活率發生不同的變化。枯草芽孢桿菌MX-6在人工腸液對照組的存活率在1～4 h時，呈現上升趨勢，此結果與植物乳桿菌R 1對人工腸液的耐受性相吻合。而在0.1%～0.4%膽鹽濃度的人工腸液中，隨著膽鹽濃度的升高，枯草芽孢桿菌MX-6的存活率呈現下降趨勢，但膽鹽的耐受能力高于植物乳桿菌GF103、植物乳桿菌AR 326及植物乳桿菌DJ-04[22-23]。所有處理組的存活率均達到72.61%以上，說明植物乳桿菌MXG-68對人工腸液和膽鹽的耐受性較強。

2.5 植物乳桿菌MXG-68的黏附特性

黏附能力是益生菌定植于宿主腸道并發揮益生作用的前提條件，只有具備高黏附能力才能在適宜條件下迅速繁殖，合成大量的抑菌代謝產物，近而有助于調節胃腸道菌群平衡及激發免疫力。Caco-2細胞的形態及功能與正常小腸上皮細胞很接近，是研究益生菌黏附能力及機制較好的模型[24-26]。將經熒光標記標記的植物乳桿菌MXG-68與Caco-2細胞孵育結束后，經過計算獲得植物乳桿菌MXG-68對Caco-2細胞的黏附率高達64%，其黏附率高于周晏陽（42%）和白潔（60%），黏附率不同可能是由于菌株個體差異所造成[27-28]。

2.6 植物乳桿菌MXG-68的耐藥性

宿主由于預防或治病為目的會使用抗菌藥物，益生菌在應用過程中難免會遇到各種抗菌藥物，導致其生長繁殖受到抑制，難以發揮更好的益生作用。且耐藥基因存在于質粒上，易出現水平漂移，造成耐藥性水平擴散，耐藥性是判斷菌株是否可成為益生菌制劑的關鍵條件之一。植物乳桿菌MXG-68對40種抗菌藥物表現出敏感性，但敏感的程度不同，對左氧氟沙星表現為低敏，對11中抗菌藥物包括頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢唑啉、呋喃妥因、先鋒霉素Ⅳ、先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、利福平、羧芐青霉素、恩諾沙星表現為中敏，對其他28種抗菌藥物均表現為高敏（見表2）。與李平蘭、楊建濤的研究結果有所不同[29-30]。

表2 植物乳桿菌MXG-68對40種抗菌藥物的敏感性

3 結 論

植物乳桿菌是人及動物腸道中正常的有益菌群之一，是工業生產中選擇制備益生菌制劑及食品發酵劑的常用菌種，具有調節腸道菌群平衡、抑制有害菌定植、增強腸黏膜免疫等功能。分析植物乳桿菌的抑菌范圍寬窄、耐受性強弱、黏附性強弱及藥敏性是益生菌篩選過程中的重要指標，直接決定了其存活率及在腸道停留的時間[31]。本研究綜合分析了植物乳桿菌MXG-68的益生特性，結果表明該菌株所產的細菌素同時可抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，屬于廣譜細菌素，動力學曲線說明菌株的活力強、達到最大生長量和細菌素合成量所需的時間短，對人工胃液、人工腸液和膽鹽具有較強的耐受性，對Caco-2細胞的黏附率高達64%，對40種抗菌藥物均表現為敏感。綜上所述，植物乳桿菌MXG-68具有作為益生菌的潛力和基本條件，有利于植物乳桿菌及其細菌素作為微生態制劑及新型生物防腐劑的應用，為實現工業化應用奠定基礎。