基于沉淀凈化法的氣相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中的肌醇

許文琪,吳凌,劉文菁,黃何何,黃永輝,胡朝陽

（福建省產品質量檢驗研究院，福州350002）

0 引 言

肌醇，又名環(huán)己六醇，是一種水溶性維生素，廣泛存在于各種天然動物及微生物組織中，因最初是由肌肉組織中提取，故取名肌醇[1]。肌醇是一種“生物活素”，能夠促進細胞生長和維持動物生理功能，對疾病具有免疫、預防和治療作用。人體每天對肌醇的需求量是1～2 g，若缺乏將會出現(xiàn)生長停滯和毛發(fā)脫落等現(xiàn)象，所以在許多保健飲料和兒童食品中都加有微量肌醇[2]。在嬰幼兒配方乳粉中，肌醇屬于可選擇性添加成分，GB 19765-2010、GB 19767-2010[3-4]對添加了肌醇的乳粉中肌醇的添加量均作出明確規(guī)定，規(guī)定肌醇含量為1.0～9.5 mg/100 k J，因此準確測定乳粉中肌醇的含量至關重要[5]。

目前，有關文獻報道的肌醇檢測方法多適用于肌醇制劑和保健食品，常用的測定方法有重量法、微生物法、高碘酸鉀氧化法、高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）[6-14]等。目前，氣相色譜法為食品安全國家標準《食品中肌醇的測定》（GB5009.270—2016)[15]明確規(guī)定檢測嬰幼兒配方奶粉中肌醇含量的標準方法，GC法是將肌醇硅烷化處理后測定[16]，但是由于奶粉中成分復雜，內含有豐富的蛋白質、維生素等營養(yǎng)成分，且會與肌醇一起衍生化，使得奶粉樣品中基質復雜，雜質峰會干擾目標化合物的定量，并且會對進樣針及色譜柱影響較大，從而影響檢測結果的準確性[17]。目前已有研究通過采用固相萃取的方法以達到去除雜質的目的[18]，但其步驟較為復雜，費時。

本研究在國家標準GB5009.270—2016的基礎上，利用加入沉淀劑乙酸鋅和亞鐵氰化鉀，去除奶粉中的蛋白質雜質。以期通過優(yōu)化肌醇測定的前處理過程，找到更為方便、準確的辦法解決雜質峰干擾問題。

1 實 驗

1.1 材料與方法

1.1.1 材料

嬰幼兒配方奶粉中肌醇定量分析質控樣品（中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心），市售嬰幼兒配方奶粉。

1.1.2 試劑

三甲基氯硅烷（分析純）、六甲基二硅胺烷（分析純）、N,N-二甲基甲酰胺（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、無水乙醇（分析純）、正己烷（色譜純）。

1.1.3 試劑配制

硅烷化試劑：分別吸取體積比為1∶2的三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷，超聲混勻。現(xiàn)用現(xiàn)配。（N,N-二甲基甲酰胺、三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷必須保證當三者混合后無白色渾濁現(xiàn)象時方可使用）。

1.1.4 儀器設備

7890A氣相色譜儀（配有FID檢測器），Agilent；分析天平，賽多利斯科學儀器；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器；旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器；離心機，貝克曼；烘箱、恒溫熱水浴槽，國華電器。

1.2 儀器條件

1.2.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-23毛細管柱（60 m×0.25 mm,0.25 μm）；進樣口溫度：280℃；檢測器溫度：300℃；分流比：10∶1；進樣量：1.0μL；程序升溫，初始溫度120℃，保持1 min，以10℃/min升到190℃，保持3.5 min，再以35℃/min升到250℃，保持10 min；外標法定量。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

稱取1 g樣品（精確到0.1 mg）10份于10個50 mL容量瓶中，用12 mL，40℃溫水溶解，超聲10 min。加入沉淀劑（5 mL亞鐵氰化鉀和5 mL乙酸鋅），用體積分數(shù)95%乙醇定容至50 mL，振蕩混勻，靜置20 min，取10 mL于離心管中，以4 500 r/min離心5 min，取上清液5 mL于旋轉蒸發(fā)濃縮瓶中。

1.3.2 干燥與衍生

向濃縮瓶中加入10 mL無水乙醇，在85℃下旋轉濃縮至近干時再加入5 mL無水乙醇繼續(xù)濃縮至干燥，轉移濃縮瓶至烘箱中100℃烘干1 h。加入10.0 mL N,N-二甲基甲酰胺，超聲溶解5 min并轉移至25 mL有螺紋蓋的離心管中，加入硅烷化試劑3.0 mL并放于80℃水浴中衍生反應75 min。其間每隔20 min取出振蕩一次，然后取出冷卻至室溫。加入5 mL正己烷，振蕩混合后靜置分層。取上層液3 mL于預先加少許無水硫酸鈉的帶螺紋蓋離心管中，振蕩后以4 500 r/min離心，取上清液供氣相色譜測定。

1.4 標準溶液配制

1.4.1 肌醇標準溶液（0.010 mg/mL）的制備

稱取100 mg（精確到0.1 mg）的肌醇標準物質于100 mL容量瓶中，用25 mL去離子水溶解完全。用95%的乙醇定容至刻度，混勻。取1 mL此溶液于100 mL容量瓶中，用70%的乙醇定容至刻度，混勻。4℃保存。

1.4.2 肌醇標準測定液的制備

分別吸取1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0、20.0 mL肌醇標準溶液于濃縮瓶中，按1.3.2步驟操作。最后得肌醇上機溶液，溶液中所含肌醇的量分別為：0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.20 mg。

1.4.3 沉淀劑的制備

亞鐵氰化鉀溶液：稱取109 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容至1 000 mL容量瓶中，混勻。

乙酸鋅溶液：稱取219 g乙酸鋅，用水溶解并定容至1 000 mL容量瓶中，混勻。

1.5 樣品的測定

選取市售嬰幼兒配方奶粉4份，每份10個樣品，按照上述試驗1.3.1-1.3.2條件進行測定，外標法定量，分別計算優(yōu)化前處理方法與國標方法中樣品的肌醇含量。

2 結果與討論

2.1 方法的線性范圍與定量

奶粉樣品中肌醇代表性圖譜如圖1。結果表明，在本實驗的實驗條件下，目標物質前后無明顯雜質峰干擾。根據(jù)標準曲線步驟測定，以肌醇的量（0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.20 mg）為橫坐標，以肌醇氣相色譜峰面積為縱坐標，繪制奶粉中肌醇含量測定的標準曲線。

圖1 肌醇代表性圖譜

圖2 肌醇的標準曲線

圖2顯示，在0.01～0.20 mg范圍內，肌醇濃度和肌醇檢測色譜峰面積具有良好的線性相關性，r為0.99996。在此濃度范圍內，能夠實現(xiàn)對肌醇的準確定量檢測。在本實驗條件下，肌醇的檢出限為1.0 mg/100g（3倍信噪比），定量限為3.0 mg/100g（10倍信噪比）。符合嬰幼兒配方中肌醇含量檢測的要求。

2.2 方法的精密度與回收率

稱取1 g（精確到0.1 mg）嬰幼兒配方奶粉肌醇質控樣品若干份，添加10 mg/100g水平，按照1.3.1-1.3.2的實驗條件下進行測定，通過對試樣前處理方法進行改進，分析國標法與前處理凈化法對分析結果的影響。測定結果見表2，分析圖譜見圖3。

表2 試樣前處理改進對肌醇測定的影響（n=10）

圖3 試樣前處理改進對肌醇測定的影響

通過表2結果分析可知，兩種方法的測量精密度分別為3.2%與2.1%，均小于5%，兩種方法的精密度均能達到測定要求，但國標法略低于前處理凈化法。兩種方法的加標回收率分別為90%～120%與91%～102%，符合實驗要求。結果表明，國標法與前處理凈化法對樣品中肌醇含量測定結果的影響無顯著差異，均具有較高的準確性和重現(xiàn)性。并且從圖3看，前處理未凈化的樣品，雜質峰較多，前處理凈化組的雜質峰較少，前處理凈化具有更好的效果，受樣品基質影響較小。

2.3 實際樣品測定

采用國標法和本方法（前處理凈化法）對樣品進行測定，結果見表3（每個結果均為10次平行測定的均值）。

表3顯示，采用國標法測定樣品中肌醇含量，各次重復測定標準差＜2%；本方法各次重復測定標準差也＜2%；通過對實際樣品添加10 mg/100g水平，國標法回收率為96%～103%，本方法平均回收率為95%～99%，本方法測定結果準確性和各次重復測定標準差與國標法相比，沒有顯著性差異。基于本方法能夠除掉樣品中大部分蛋白質，更為方便、準確的解決雜質峰干擾問題。并且可以減輕對儀器的損傷，因此可采用本方法測定嬰幼兒配方奶粉中的肌醇含量。

表3 2種方法對實際樣品中肌醇含量的測定結果（mg/100g）

3 結 論

本研究通過對樣品的前處理進行優(yōu)化，在樣品中加入沉淀劑乙酸鋅和亞鐵氰化鉀，去除奶粉中的雜質蛋白質，對試樣進行凈化處理，濃縮，經(jīng)硅烷化試劑衍生，正己烷提取，外標法定量，用配有FID檢測器的氣相色譜測定其肌醇含量。結果顯示，本方法能夠除掉樣品中大部分的蛋白質，色譜雜峰較少，受樣品基質影響小，樣品檢測結果回收率在95%～99%，且各次重復測定標準差＜2%，可以滿足奶粉樣品中肌醇含量的準確測定；分別采用國標法和本方法對樣品中肌醇含量進行測定，結果顯示兩種方法無顯著性差異。適合于嬰幼兒配方奶粉中肌醇含量的分析測定。并且改良的氣相色譜法完全能夠滿足嬰幼兒配方奶粉中肌醇含量的測定，具有較高的回收率和重現(xiàn)性，更為方便、準確的解決雜質峰干擾問題，提高檢測的準確性。