“奧尼爾”藍莓組培初代培養制約因素初探

李軍萍，徐崢嶸

（云南省玉溪農業職業技術學院，云南玉溪 653106）

藍莓（Vaccinium corybosum）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，其果實為藍色或紅色，酸甜適中，營養豐富，特別是抗氧化能力為所有果品蔬菜之首，具有極高的營養價值和醫療保健作用，堪稱“世界水果之王”，被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一[1]。現今，主要的商業栽培品系有高叢藍莓、矮叢藍莓、兔眼藍莓等，其中高叢藍莓是分布最廣泛的一個品系，奧尼爾是南高叢藍莓的代表品種之一，適合栽培在暖溫帶至亞熱帶地區，極早熟至早熟，極豐產，果個大，暗藍色，果粉較多，果肉質硬，香味濃，風味佳，果蒂痕小、耐貯運，對土壤的適應性較強，適宜在我國長江流域大部分地區種植[2]。 作為本世紀極具發展潛力的一個新興樹種，大規模發展藍莓產業勢在必行。但由于其材料來源有限，繁殖系數低，無法實現規模化生產，而組織培養是解決這一問題的重要途徑。目前研究者獲得眾多不同藍莓品種的快繁體系，但奧尼爾藍莓品種組培初代培養的研究卻鮮有報道。本文以奧尼爾藍莓為材料，研究滅菌劑，基本培養基，激素濃度和種類，活性炭濃度對藍莓初代培養的影響，以期獲得同一藍莓品種在組織培養技術中共性的歸納和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為一年生藍莓品種“奧尼爾”，選用健壯無病害的帶單腋芽的莖段。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同滅菌劑對外植體生長的影響

取藍莓“奧尼爾”品種半木質化枝條，去掉上部老葉片后，將其剪成 1.5 ～2 cm 莖段（帶 1個葉芽）為外植體，先用洗衣粉浸泡 8 min，然后用自來水沖洗 30 min 后，進行3 次重復消毒，消毒設置 6 個處理：① 75%酒精浸泡 30 s + 0.1%升汞浸泡 5min+無菌水沖洗 5 次；② 75%酒精浸泡30 s+ 0.1%升汞浸泡 10 min+無菌水沖洗 5 次；③75%酒精浸泡 30 s+ 0.1%升汞浸泡 15 min+無菌水沖洗 5 次；④ 1%次氯酸鈉浸泡10 min+0.1%升汞浸泡 5 min+無菌水沖洗 5 次；⑤ 1%次氯酸鈉浸泡10 min+0.1%升汞浸泡 10 min+無菌水沖洗 5次；⑥ 1%次氯酸鈉浸泡10 min+0.1%升汞浸泡 15 min+無菌水沖洗 5 次。每個處理接種 20 個外植體，外植體消毒后接入改良WPM +ZT 1.5 mg/L 啟動培養基中，培養30 d 后統計各處理的污染率及外植體長勢。

1.2.2 基礎培養基選擇

以“奧尼爾”帶腋芽莖段為外植體， 設置 4 個處理：分別以MS、White、B5、改良 WPM（以水合硝酸鈣 684.00 mg/L、硝酸鉀 190.00 mg/L 和鹽酸硫胺素 0.10 mg/L 代替原 WPM 培養基中的硫酸鉀、氯化鈣、硫酸亞鐵）為基礎培養基，基礎培養基中附加激素 ZT1.5 mg/L，1 個月后觀察其對愈傷組織和不定芽增殖生長的影響，每個處理接種 20 個外植體，3 次重復；培養60 d 后統計各處理腋芽誘導率與腋芽增殖倍數。

1.2.3 不同激素對叢生芽誘導效果

將消毒后的外植體分別接種到含不同激素種類、濃度的改良 WPM 誘導培養基上。共設置8 個處理：6-BA 質量濃度 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L，ZT 質量濃度 0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L 。每個處理設置 3 次重復，每個處理接種20 個外植體，60 d 后統計不同處理增殖倍數。

1.2.4 活性炭濃度對外植體褐化的影響

活性炭濃度設置 5 個處理：① 改良WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L； ② 改 良WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+100 mg/L 活 性 炭；③ 改 良WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA0.2 mg/L+200 mg/L 活性炭；④ 改良 WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+400 mg/L 活性炭；⑤ 改良WPM+ZT 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+800 mg/L 活性炭；每處理接種 20 個外植體，3次重復；分別在 7 d、14 d、21 d、28 d 統計藍莓外植體褐化率。

1.3 數據處理分析

污染率=污染外植體數/接種外植體總數×100%；

褐化率=褐化外植體數/接種外植體總數×100%；

腋芽誘導率=誘導出腋芽外植體個數/成活下來外植體個數×100%；

腋芽增殖倍數=誘導出叢芽個數/誘導出腋芽的外植體個數；

采用Microsoft Excel 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌劑對外植體生長的影響

由表1 知，不同滅菌劑對藍莓外植體消毒及生長影響很大，其中處理⑤對于降低外植體污染率及長勢效果較好。處理①、④滅菌不充分，污染率均超過 50%，其中處理①的污染率達到 80%，雖然側芽生長好，但有愈傷組織出現玻璃化現象；處理③、⑥滅菌過度，雖然污染率降低到3%以內，但側芽長勢均較差，褐化嚴重；處理②和⑤污染率分別為14%和10%，側芽生長旺盛，輕微褐化。

表2 不同基本培養基對藍莓莖段培養比較

2.2 基礎培養基選擇

由表2 知，不同基礎培養基對藍莓“奧尼爾”腋芽誘導和增殖的影響較大，其中改良WPM 培養基對腋芽誘導效果最好，腋芽誘導率為70%，平均叢生芽為7.1 個；White 培養基誘導莖段腋芽的效果最差，平均叢生芽數為0.5，腋芽誘導率僅為5.30%，可以認為White 培養基不適合 “奧尼爾”的初代培養。

2.3 不同激素處理藍莓腋芽的誘導效果

由表3 知，不同激素對藍莓“奧尼爾”腋芽誘導和增殖的影響較大，其中ZT 對于腋芽的誘導倍數明顯高于6-BA，當 ZT 濃度從 0.5 mg/L 增大至3.0 mg/L 時，腋芽平均增殖倍數呈先升高后降低趨勢，其中ZT 濃度為2.0 mg/L 時對腋芽誘導的倍數最高，達到6.5 倍。6-BA 在0.5 mg/L 至3.0 mg/L范圍內對于腋芽誘導也有一定作用，但效果明顯低于ZT，增殖倍數僅為1.1 ～2.3 倍。

2.4 不同活性炭濃度對外植體褐化的影響

從下圖可知，活性炭對于降低藍莓外植體褐化率效果明顯。未添加活性炭的處理中，從第7 ～28 d，褐化率在所有處理中均為最高，在28 d 時達到21.6%。隨著活性炭濃度從100 mg/L 增至800 mg/L，藍莓外植體褐化率呈先降低后升高的趨勢。其中添加 200 mg/L 活性炭時褐化率達到最低，到28 d 時僅為4.8%。表明適宜的活性炭濃度能有效降低外植體褐化率。

3 討論與結論

3.1 討論

活性炭對外植體褐化的影響圖

外植體消毒是組織培養開始無菌體系構建的第一步。各種植物及不同器官對消毒時間、方式都不一樣。消毒過程中合適的消毒劑既要能殺死植物材料表面微生物，同時又要盡可能減輕對母本植物材料造成傷害。本研究中，1%次氯酸鈉10 min+0.1%升汞10 min 既降低外植體的污染率，同時側芽長勢良好；而75%酒精30 s+ 0.1%升汞15 min 雖然污染率大大降低，但側芽長勢差，褐化嚴重。李麗容、李杰等[3-4]研究結果表明，藍莓外植體莖段用0.1% HgCl2消毒時間為6 ～9 min 時最好，成活率最高；陶興魁等[5]研究表明：一般而言，菌類污染污染率應控制在 8%以內；金如意[6]研究結果表明用5% NaClO 溶液消毒10 min、用0.1% HgCl2溶液消毒7 min 時外植體的消毒效果最好。本研究中，藍莓品種“奧尼爾”的消毒方法與其基本一致。

基本培養基主要提供植物生長所需的營養物質，但不同的植物，因其遺傳、生物學特性不同，對營養成分的需求也不一樣。合適的培養基是植物組織培養成功的關鍵，而選擇正確的基本培養基則是組織培養的基礎。據報道藍莓組織培養中所用的培養基較多，常用的是 MS、1/2MS、White、WPM、改良WPM、knops 培養基和B5 等幾種。不同基本培養基對藍莓不同品種腋芽的誘導效果也不同。陶俊鋒[7]等研究表明，兔眼藍莓品種“燦爛”腋芽誘導與增殖的最適合培養基為1/2MS；廉家盛[8]等認為，B5 培養基最適合“美登”藍莓不定芽增殖生長；馬艷麗[9]等研究得出，對于高叢藍莓用改良MS 培養，最高再生率可達75% ；而對兔眼藍莓用改良knops 培養最合適；饒寶蓉、陸衛明、沙玉芬、王明瑩[10-13]等認為WPM 培養適用于藍莓品種“夏普藍”、北高叢藍莓品種“杜克”、矮叢藍莓品種“美登”等莖段誘導。本研究結果表明，改良WPM 基本培養基有利于南高叢品種“奧尼爾”莖段腋芽的誘導和增殖，可能是由于改良WPM 含有較高的無機鹽濃度和較多的Ca 元素，適應藍莓的生長。

表3 不同激素及濃度對藍莓腋芽誘導比較

植物組織培養中， 細胞分裂素對芽的誘導和增殖起到至關重要的作用 。廉家盛[8]、李森、史文君、蘇艷、張力思[14-17]等研究表明ZT 對藍莓叢生芽的誘導和增殖具有顯著效果，且不同的藍莓品種其用量也有差別。本研究表明：當 ZT 濃度從 0.5 mg/L 增大至3.0 mg/L 時，腋芽平均增殖倍數呈先升高后降低趨勢， 這個規律與徐宏[18]等研究一致；而最適合“奧尼爾”的誘導 ZT 濃度為2.0 mg/L。本試驗中，6-BA 對促進藍莓生長、增殖的效果不十分明顯，這與李森[14]、董朝莉[19]、趙燕麗[20]等的研究結論一致。

3.2 結論

本實驗結果表明：藍莓“奧尼爾”初代培養中，莖段的最佳消毒方式為1%次氯酸鈉10 min+0.1%升汞10 min，改良WPM 培養基對腋芽誘導效果最好，ZT 濃度為2.0 mg/L 時對腋芽誘導的倍數最高，添加 200 mg/L 活性炭時褐化率達到最低。在植物組培初代培養過程中，影響制約外植體成苗的因素很多，本試驗僅對藍莓“奧尼爾”滅菌劑、基本培養基、激素濃度和種類、活性炭濃度進行了初探，外植體的部位、取材時間，不同激素的配比、光照條件等因素仍需要進一步研究。