發(fā)酵型硫酸軟骨素的研究現狀及前景解析

王伙根，羅 程，張森林

（嘉興恒杰生物制藥股份有限公司，浙江嘉興 314005）

采用分離的方法在動物軟骨中提取高分子量酸性茹多糖，即硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS），其作用是促進軟骨再生，并且具有抗炎、降血脂、預防關節(jié)炎等效果。將硫酸軟骨素制作成相關產品，比較常見的有滴眼液、化妝品，一些歐美國家將硫酸軟骨素作為關節(jié)炎、心絞痛等疾病的治療元素。采用發(fā)酵法生產硫酸軟骨素，有利于提高產品質量與效益，降低污染與能耗，下面結合發(fā)酵型硫酸軟骨素展開討論。

1 發(fā)酵型硫酸軟骨素

硫酸軟骨素是一種胺聚糖類大分子酸性多糖，萃取來源為鯊魚、牛、豬等動物的軟骨，在人體中常見于軟骨、肌腱等結締組織，將CS、透明質酸、硫酸角質素、核心蛋白聚合之后，便可以獲得蛋白聚糖，在醫(yī)學領域有極高的應用價值，有人體“軟黃金”之稱[1]。另外，CS也可以作為膳食補充劑、保濕劑在食品與化妝品行業(yè)得到運用。

因為硫酸化產生位點存在差異，CS也被劃分為不同的種類，動物中提取硫酸軟骨素單體以CS-A，C為主。實施CS的工業(yè)化生產，一般會在酶法、堿法中選擇合適的工藝，在動物氣管與雞龍骨等軟組織內完成提取。我國作為CS產業(yè)大國，在全世界CS總產量中占比達到80%，雖然如此，但是CS原料生產環(huán)節(jié)，卻依然面臨周期過長、工藝繁瑣、效率低等量問題。所以，解決CS原料、生產技術、產品質量等方面的問題，科學選擇生產工藝非常重要。

CS不僅存在于動物軟骨組織中，還通過莢膜多糖這一形式存在于微生物細胞壁，采用發(fā)酵法培養(yǎng)微生物細胞也能夠獲得CS，這是經濟效益相對較高的生產工藝之一。發(fā)酵法在硫酸軟骨素生產中應用，可以解決以上問題，并且成為當前生產、研究的重點。

2 采用發(fā)酵法生產硫酸軟骨素

生產、聚合硫酸軟骨素與類似物，可以將自然界中的微生物作為主要原料，如果是在工業(yè)領域生產菌株，多采用巴斯德桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等微生物。其中，大腸桿菌屬于原核模式微生物，具有清晰的遺傳背景，在莢膜多糖合成、轉運機制這兩個方面有非常深入的探究，也是CS與類似物進行發(fā)酵生產的關鍵性菌株。但是大腸桿菌發(fā)酵產物是K4CPS，果糖軟骨素務必要在脫果糖、硫酸化修飾等多個環(huán)節(jié)的處理之后方可得到CS，使得生產工藝更加復雜，也直接增加了成本。盡管巴斯德桿菌可以通過合成獲得軟骨素類莢膜多糖，但是其中涉及家禽霍亂致病菌。所以，當前針對發(fā)酵型CS的生產研究，多是以巴斯德桿菌typeF中軟骨素作為酶pmCS合成的主要來源，將其體外酶轉化之后可以得到軟骨素多糖鏈。納豆芽胞桿菌經過發(fā)酵后可以獲得硫酸軟骨素，但是這種方法產量不高，只有0.24g/L，選擇產量較高的CS枯草芽孢桿菌，將其發(fā)酵處理后進行優(yōu)化，可以提高CS產量為4.2g/L（32h）[2]。其中運用到的枯草芽孢桿菌是CS生產菌，可以保證生產產品的安全性，節(jié)省生產過程中的硫酸化修飾環(huán)節(jié)。所以，枯草芽孢桿菌在發(fā)酵型硫酸軟骨素生產中，可以作為最佳菌株得到應用。

為了能夠顯著提升CS產量，建議將大腸桿菌O5：K4：H4當作出發(fā)菌株，設置隨機誘變條件為N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍，篩選條件則設定為莢膜圈。經過發(fā)酵生產之后，突變株產量可以提高80%。分析高產生理機制總結，軟骨素合成酶密碼子在發(fā)酵生產期間出現錯義突變，增加了親和力。由此可見，軟骨素合成酶對于CS合成效率的提升起到重要作用。針對合成莢膜多糖的渠道進行分析，發(fā)現其中單糖前體是多糖聚合酶底物，含量的豐富性是CS多糖合成效率非常關鍵的影響因素之一[3]。因此，大腸桿菌內部UDP-葡萄糖脫氫酶的過量表達，顯著提升了UDP-GlcA的含量，莢膜多糖產量降低。可知如果只是單獨提高前體物質的含量，會對多糖成酶產生一種競爭性的抑制效果。合成莢膜多糖的過程中包含諸多流程，例如單糖合成、核糖供應、膜轉運蛋白等，若想提高CS產量，建議從轉錄水平著手優(yōu)化表達莢膜多糖合成基因簇。

因為大腸桿菌野生質粒對外源質粒有排斥作用，會遺失重組質粒，發(fā)酵罐內培養(yǎng)，培養(yǎng)時間以24h為宜，所有重組質粒遺失，從而影響到重組菌的培養(yǎng)規(guī)模。所以，提高K4菌株內部目的基因穩(wěn)定性，是進行分子改造非常重要的目的，建議采用以下三種方法：第一，將內源質粒全部清除，消除排斥性；第二，可以兼容內源質粒的外源質粒當作載體得到應用；第三，將內源質粒當作載體。以上三種方法必須要以解析質粒pK4EC05的特性為基礎，pK4EC05測序結束之后便可以總結得出插入外源基因，提高CS產量。

3 發(fā)酵型硫酸軟骨素研究現狀與前景

3.1 研究現狀

雖然枯草芽孢桿菌在CS生產中屬于潛在生產菌株，但是相關研究處于不夠深入，最早關于CS的研究是在1988年，當時大腸桿菌O10：K4：H4莢膜多糖結構已經被確定為果糖軟骨素，隨后在1996年針對K4菌株發(fā)酵展開探究，發(fā)現Rodriguez發(fā)酵培養(yǎng)基，經過24h之后CS產量顯著提高，由此也肯定了發(fā)酵法在CS生產中的地位[4]。

首先，在發(fā)酵條件方面，莢膜多糖合成、細胞生長這兩者的營養(yǎng)物質、能量存在競爭關系，所以碳源可以作為一種重要的營養(yǎng)元素，對細胞生長速率進行調整。對比葡萄糖、甘油 這兩種物質在大腸桿菌莢膜多糖、生長效率兩個方面的作用，發(fā)現濃度提升之后均可以提升莢膜多糖產量，對比發(fā)現甘油的效果更為理想。如果氮源量少，那么葡萄糖濃度一旦增加，便會在發(fā)酵液內形成副產物，對莢膜多糖合成產生抑制作用。如果甘油吸收率低，糖酵解代謝流與副產物產生量也會因此降低，這時濃度增加之后也會加速莢膜多糖合成。

其次，細胞壁中莢膜多糖是非常重要的一部分，合成效率與胞內能量狀態(tài)有直接關系。高溶氧保證胞內能量充足供應，加速多糖合成。如果DO值不足10%，則CS比合成速率降低幅度明顯，甘油消耗加速，發(fā)酵液內部有副產物產生。

再次，對于發(fā)酵工藝的選擇，莢膜多糖屬于細胞表面成分，如果微生物處于指數生長期，此時合成CS會在轉入穩(wěn)定期之后產量達到最高。如果是在高溶氧環(huán)境下，不斷補充碳氮源，細胞濃度與莢膜多糖產量也顯著提升。但是副產物大量積累之后細胞得率、轉化率卻相對降低。建議運用微膜生物反應器，將微生物細胞截留，可以減少副產物產生量，消除高密度培養(yǎng)期間細胞副產物具有的抑制作用，提高CS產量與細胞得率。

3.2 研究前景

現如今，受到全球老齡化趨勢的影響，硫酸軟骨素在臨床與市場中的應用范圍逐漸擴大，根據研究預計今后硫酸軟骨素年復合增長率需求、市場容量、產量將會不斷提升。另外，在實踐應用方面，我國的藥用硫酸軟骨素的市場規(guī)模也呈現擴張的趨勢，發(fā)酵法作為硫酸軟骨素的生產工藝之一，目前已經得到廣泛應用，憑借其在生產質量、效率、環(huán)保等方面的優(yōu)勢，今后必將會得到重視，為硫酸軟骨素生產提供先進工藝支持。

4 結束語

綜上所述，硫酸軟骨素作為我國醫(yī)療、食品與化妝品等行業(yè)的重要元素，采用發(fā)酵法進行產品生產，有利于提高生產過程的效率，保證最終生產質量。生產環(huán)節(jié)的損耗減少，也不會對周圍環(huán)境造成影響，具有綠色節(jié)能的特點。今后發(fā)酵法在硫酸軟骨素生產中應用，也必將會成為一種有效工藝。