生物樣品中兒茶酚胺的分析方法研究進展*

周 慧，董 佳，賀茂芳,2**，劉文杰，程清軒，何孝文

(1.西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021；2.西安醫學院 藥物研究所，陜西 西安 710021)

兒茶酚胺(Catecholamines，CAs)類物質主要包括去甲腎上腺素(Norepinephrine，NE)、5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)、腎上腺素(Epinephrine，E)和多巴胺(Dopamine，DA)[1]。CAs既是神經傳導介質，也是內分泌激素，在生物體內發揮重要的生理功能。臨床上，可通過檢測人體中血漿或尿液中CAs的濃度水平用于診斷高血壓、糖尿病、甲狀腺功能異常等內分泌相關的疾病[2-3]。因此，建立選擇性好、靈敏度高、快速準確的分析方法具有重要意義。目前，測定CAs的方法有高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(CE)、電化學法和熒光光度法(FL)等。作者就近年來CAs的測定方法進行了評述，將為發展CAs的檢測新方法提供參考依據。

1 HPLC法

HPLC法由于具有方便、快速、準確等優點，是CAs最常用的分析方法。由于CAs分子中的氫鍵易于和硅醇基形成氫鍵，從而造成不可逆吸附，因此通常向流動相中加入酸改善峰型；或者向流動相中加入離子對試劑，如十八烷基磺酸鈉，采用離子對色譜進行分離。HPLC法常與電化學檢測器(ECD)、熒光檢測器(FLD)、質譜(MS)等聯用，以提高靈敏度[4]，ECD因其高靈敏度、高分離效率成為首選。

1.1 HPLC-ECD

李靜娜等[5]建立了HPLC-ECD法測定人體血清中的CAs，首先采用氧化鋁作為固相萃取材料對CAs進行預富集，再運用HPLC-ECD檢測，獲得最低檢出限為0.1 ng/mL。該方法操作簡單，所需生物樣本少，同時，還具有靈敏度高、回收率和重現性良好的優點。

于夢洋等[6]應用HPLC-ECD檢測大鼠血清中的E、NE以及DA的含量，研究了束縛擠壓傷大鼠血清中CAs的變化。結果顯示，E、NE及DA的分離效果良好，無內源性雜質的干擾，各物質的回收率分別為98.54%、99.21%和97.31%。

張文等[7]以摻鈰納米二氧化鉛修飾電極作為HPLC的檢測器，建立了人體腦脊液中DA等單胺類神經遞質及其代謝產物的測定方法。該修飾電極具有良好的電催化作用，獲得了較高的靈敏度和良好的重現性。

曾文芳等[8]采用離子色譜分離、碳納米管修飾電極檢測，以c(硫酸)=10 mmol/L-φ(乙腈)=10%溶液為流動相測定CAs。該方法的檢出限為0.04～0.09 ng/mL，回收率為96%～102%，具有準確度高、精密度好的特點，是一種簡單快速的分析方法。

吳朝陽[9]等人為減少血漿用量、提高實驗穩定性，采用弱陽離子固相萃取小柱聯合HPLC-ECD法提取并檢測人體血漿中的CAs。該方法的結果準確可靠、靈敏度好、操作簡便，適合于臨床診療的需要。

Tolmacheva等[10]采用超交聯聚苯乙烯進行預富集，聯合HPLC-FLD法檢測CAs，優化了NE、DA和E的預富集條件為微柱(10 mm×6 mm)、吸附劑質量0.03 g、溶液體積25 mL(pH≈8.5)，溶液透過率1.0 mL/min。將該方法應用于尿液中CAs的分析檢測，準確性高、重現性好。

1.2 HPLC-FLD

鄧祖躍等[11]采用HPLC-FLD法測定了不同腦區CAs及其代謝產物的含量，作者優化色譜條件，建立了新的梯度洗脫系統，既可以檢測常見的3種CAs，也可以檢測其對應的代謝物。該方法簡便準確、分離度高、重復性好，適用于一般實驗室腦組織中CAs及其代謝產物的測定。

張璐璐等[12]采用HPLC-FLD法研究了小鼠腦皮層、丘腦等不同部位的單胺類神經遞質及其相關物質。樣本經高氯酸沉淀蛋白后進行色譜分析，7種目標物在45 min內完全分離，并且樣本基質無干擾。該方法鑒別出小鼠腦中存在NE、DA和E等物質，結果準確，同時提取回收率大于90%。

喬坤云等[13]采用HPLC-FLD法檢測CAs，可同時分離測定NE、DA和E 3種組分。該方法的前處理簡單易操作，同時也具有較高的靈敏度和穩定性。

1.3 HPLC-MS

HPLC-MS法能夠高效、高靈敏度分離和檢測待測物質，但為了提高分析結果的準確度和選擇性，通常需要復雜的樣品前處理過程[14]。

郭玲等[15]利用HPLC-MS法對大鼠血漿中的DA、E以及NE等7種神經遞質進行了快速有效檢測。首先采用Waters XSelect@HSS PFP色譜柱進行分離，然后以乙腈-φ(甲酸)=0.1%和水-φ(甲酸)=0.1%溶液為流動相進行梯度洗脫。通過優化質譜條件，避免了假陽性結果，提高了方法的準確度。

丘秀珍等[16]運用DA作為模板，多孔的陽極氧化鋁膜為反應載體，合成了DA印跡聚合物納米管膜，通過HPLC法研究了其對CAs的吸附性能。結果顯示，在最優萃取條件下，DA印跡聚合物納米管膜對NE、DA和E均具有較好的選擇性，該方法能快速、準確的檢測出人尿液中CAs的含量。

亓偉梅等[17]通過建立超高液相色譜(UHPLC)-MS/MS法，實現了微量大鼠腦微透析液中3種CAs的高靈敏檢測。該方法可以快速、準確地檢測出3種組分，能夠滿足大鼠腦微透析液中CAs的檢測要求，具有一定的檢測優勢。

黃鑫等[18]采用HPLC-MS法檢測大鼠和海馬大腦皮層中生物胺及氨基酸類神經化學物質的含量，比較了不同腦組織樣品前處理方法對測定結果的影響，實驗結果靈敏度高、專屬性強，可為CAs提供有效的樣品前處理方法和檢測手段。

2 電化學法

CAs在電極表面呈現不同的電化學行為，因而具有不同的氧化峰電流和電極電位，從而可使用電化學法對其進行檢測?，F階段，電化學法檢測CAs的主要方法為化學修飾電極法，該方法將聚合物膜修飾在電極表面從而提高電極電催化性能。鄧克勤等[19]通過電聚合法制備了硫堇膜修飾電極，研究了CAs在該電極上的電化學行為，與裸玻碳電極相比，氫化峰電流增大且峰電位負移至165 mV。該電極的重現性較好，實現了對CAs和氫醌的同時測定。R Ramaraj研究小組[20]采用聚吖嗪和聚酚藏花紅膜玻碳修飾電極，同時測定了DA和抗壞血酸，其線性范圍分別為5.0×10-5～5.0×10-4mol/L和5.0×10-5～1.0×10-3mol/L。Yi等[21]首次報道了聚乙烯醇縮丁醛/氧化石墨烯(PVB/GO)納米復合膜電化學傳感器用于CAs代謝產物的同時測定。PVB/GO修飾玻碳電極對高香草酸和香草醛扁桃酸的氧化具有良好的親和性和電催化活性，差分脈沖伏安法顯示這2種代謝物在修飾電極上的峰電位幾乎一致。研究者從線性范圍、精密度、穩定性、重復性和回收率等方面對傳感器的性能進行了評價，證明該傳感器具有成本低、穩定性好、靈敏度高的優點。

為了提高分析的選擇性，Kajisa等[22]以DA為模板，在場效應晶體管(FET)生物傳感器的Au柵電極上合成了分子印跡聚合物(MIP)，該電極在40 nmol/L～20 μmol/L對DA有顯著的響應，而非印跡聚合物涂層的FET柵極表面電位幾乎沒有變化，證實了DA-MIP涂層FET傳感器對DA的選擇性和定量檢測。

納米材料具有特殊的物理性能、優異的光電化學性質，將納米材料用于電極的表面修飾能有效提高電極的催化性能，提高選擇性和靈敏度。例如，謝云峰等[23]將羧基化多壁碳納米管(MWNTs)修飾在玻碳電極表面，用于DA和5-HT的研究，發現羧基化MWNTs修飾電極對DA和5-HT具有顯著的電催化作用，可用于這2種物質的同時測定。

3 CE法

CE是一種高效的分離技術，在藥物分析、體液成分的分離與分析等方面具有廣泛的應用，具有樣品用量少、成本低廉等優點。CE法依據待分離物質的電荷性質進行分離，由于分析物易于和毛細管壁作用，所以通常需要對毛細管進行修飾，從而實現基線分離，確保重現性。CE通常與化學發光法(CL)、MS、紫外檢測器(UV)等聯用，用于CAs的檢測。

3.1 CE-CL法

張東明等[24]建立了用半導體激光誘導熒光結合CE測定NE和DA的分析方法，考察了青色素衍生物(Cy5)對NE和DA的各種衍生條件。在優化條件下，NE和DA在3×10-8～5×10-6mol/L內與其熒光強度呈線性關系。NE和DA的最低檢測濃度分別為5.9×10-9、5.4×10-9mol/L。該方法的優點是簡便、靈敏、樣品用量少，適合于痕量單胺類神經遞質的分析。

徐向東等[25]基于堿性介質中CAs對魯米諾-Ag(Ⅲ)化學發光體系有增敏作用的原理，建立了CE-CL法檢測DA、E與NE的新方法。在優化的電泳和化學發光條件下，DA、E與NE可獲得良好分離，其檢出限(S/N=3)分別為10、100、200 ng/mL。

李欣欣等[26]基于堿性條件下CAs淬滅鐵氰化鉀-魯米諾發光的原理，建立了CE-CL技術分離測定3種CAs的方法。在最佳條件下，測得DA、E、NE的檢出限分別為50.49、329.76、406.03 ng/mL。該方法采用的間接化學發光法是基于酚類物質與鐵氰化鉀之間的氧化還原原理，因此，生物樣品中的蛋白質、氨基酸及糖類等無還原性的物質不會產生信號，從而大大提高了選擇性。

3.2 CE-MS

王賢親等[27]采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱，以乙腈-φ(甲酸)=0.1%溶液為流動相，電噴霧離子源(ESI)正離子模式，采用多反應監測方式對樣本進行定量分析。結果顯示，E、NE和DA的檢出限分別為4.3、2.4和6.6 ng/mL，線性范圍為10～500 ng/mL，平均回收率為85.8%～93.4%。該方法的專屬性強、靈敏好、準確高，適用于人血漿CAs的快速檢測。

3.3 CE-紫外光譜法(UV)

付敏等[28]建立了高效毛細管電泳結合UV檢測DA和5-HT的方法，在優化的實驗條件下，DA、3,4-二羥芐胺和5-HT在10 min內得到很好的分離，檢出限分別為3.09×103、1.42×103、2.11×103ng/mL，該法簡便快速、樣品用量少、結果準確、重現性好。

3.4 其他

張麗瑤等[29]研究了毛細管預處理方法對組胺、5-HT及CAs電泳分離的影響，采用優化的毛細管預處理方法及電泳分離條件，基線分離了組胺、5-HT、NE和E。利用DA和5-HT在毛細管內壁吸附效應的不同，對電泳淌度極為相近的DA和5-HT進行了分離和鑒定。以小鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞為研究對象，證實了該細胞中所含大量神經遞質為DA，而不是5-HT。

林玲等[30]基于CE法建立了兒茶酚及DA的主要代謝產物二羥苯乙酸(DopAC)的定量分析，靈敏度可達5×10-9g/mL，線性范圍為0.01～0.32 μg/mL。該方法用于兒茶酚和DopAC的分析具有快速、簡便、耗材少的優點。

高萍等[31]采用CE法檢測了46例正常人以及11例嗜鉻細胞瘤患者尿中NE、間甲腎上腺素(MN)、間去甲腎上腺素(NMN)和3-甲氧基-4-羥基苦杏仁酸(VMA)的含量。結果顯示，NMN和MN聯合檢測的陽性率為100%，假陽性率為19.56%。因此，CE法對NMN和MN聯合檢測對于診斷嗜鉻細胞瘤有意義。

4 光譜法

光譜法是基于物質與輻射能作用時，物質內部發生量子化能級躍遷而產生發射、吸收或散射的波長和強度進行分析的方法。

4.1 熒光法

胡紅美等[32]提出了用芯片電泳分離-激光誘導熒光光譜法測定CAs的方法。采用自制的無泵負壓進樣系統，避免了進樣歧視效應。在優化的條件下，NE、DA和E可在1 min內完全分離。3種CAs的平均遷移時間依次為30.59、37.23、46.43 s，相對標準偏差(n=7)依次為1.10%、1.28%、0.45%，線性范圍為0.3～5.0 mg/L(NE及DA)和0.05～4.0 mg/L(E)，檢出限依次為30、30、10 ng/mL。

Nikolajsen等[33]利用E和NE光譜之間的差異，通過鐵氰化鉀氧化CAs生成相應的三羥基吲哚類物質，利用硫酸鋅為催化劑，抗壞血酸為穩定劑來提高其熒光強度，所得數據用兩組分四列并行因子分析模型同步測定E和NE，檢測靈敏度可達7.5×10-8mol/L。

趙燕燕等[34]將膠束增敏與同步熒光-雙波長法用于血漿樣品中CAs的同時測定，取得了良好的結果。發射波長(λem)在370.0～550.0 nm，激發波長(λex)和λem的波長差為70.0 nm的條件下分別進行掃描，獲得同步熒光光譜圖，在385.0 nm處直接讀出DA的熒光強度。

Palop等[35]報道了利用水中的溶解O2氧化E，在堿性條件下最終形成腎上腺素黃，然后通過流動注射-FL法檢測450 nm處的吸收峰，結果顯示，對E檢測的線性范圍為0.5～20 μg/mL，檢出限為2.0×102ng/mL。

4.2 分光光度法

Nagaraja等[36]報道了重氮硝基苯胺(DPNA)在酸性條件下與CAs的衍生物反應，所產生的紅色復合物在500～510 nm處有強吸收峰，由此得出E的檢出限為1.47×102ng/mL。

Teixeira等[37]用固定在聚酯樹脂上的PbO2作為固相反應器氧化E得到的腎上腺素紅，然后在486 nm處用流動注射分光光度法檢測吸收峰，結果顯示E在1×10-4～8×10-4mol/L內有良好的線性關系，檢出限為1.47×103ng/mL。

Abdulrahman等[38]用p-甲苯胺在高碘酸鈉的氧化作用下和E形成橙色的可溶性產物，該產物在480 nm處有最大吸收峰，可用流注射分光光度法檢測，檢測下限為6.78×102ng/mL，線性范圍為2.7×10-5～3.7×10-4mol/L。

5 結束語

CAs作為生物體內重要的神經傳導介質，對其進行準確、快速和同時檢測具有重要意義。目前，CAs的檢測方法有很多，各有優勢，相互補充，為CAs的檢測提供了多種途徑。其中，HPLC、EC和電化學法是最有效的方法，具有較好的實際應用價值，為生物樣品中CAs的準確測定奠定了基礎。