骨性關節炎相關外泌體潛在診療價值的研究進展

李中杰 吳曉敏 潘曉華*

1.廣東醫科大學，廣東 湛江 524000 2.廣東醫科大學深圳寶安臨床醫學院/南方醫科大學附屬深圳寶安醫院，廣東 深圳 518100

骨性關節炎(osteoarthritis，OA)是最常見的慢性關節疾病，是人類主要的致殘原因之一，影響了全球15%以上的人口[1]。最新的流行病學研究表明，中國目前有癥狀的膝骨關節炎患者高達1.1億，這將造成重大的社會和經濟負擔[2]。在發病機制上，雖然目前的研究表明其與細胞因子、信號通路、基質金屬蛋白酶及免疫因素等有關[3]，但具體的作用機制仍未十分明確；在診斷上，目前OA診斷標準[4]不適用于早期診斷，有研究[5]發現，在OA早期能觀察到關節軟骨明顯的修復反應，而在中晚期修復效果并不理想，因此早期診斷并及時治療是關鍵所在。已知miR-140與軟骨細胞分化有關，有研究[6]表明miR-140-3p在膝關節滑液中有表達，并且與OA的嚴重程度呈負相關，提示miR-140-3p有可能成為膝關節OA早期診斷的候選標志物；在治療上，關節腔注射皮質類固醇或透明質酸對早期OA具有一定療效但又存在爭議[7]，晚期OA雖然能通過關節置換手術解決，但植入物壽命等問題一直是業界的難題?；谀壳皩A發病機制的局限性認知及突破的需要，外泌體作為一種細胞間的通訊介質因可以保護其內容物直接遞送至相關細胞發揮作用的特性而開始備受矚目[8]。如在OA早期，關節腔中的外泌體會介導抑炎因子和miRNA等協助軟骨修復，而中晚期則會誘導相關炎性因子及促炎miRNA的產生加速病理改變。

1 骨性關節炎相關的外泌體特點

外泌體(exosomes，exos)是一種直徑為30～120 nm雙層膜結構的囊性小泡，可遠距離膜性轉運供體細胞內的生物小分子(核酸、蛋白等)至受體細胞發揮調控作用，它幾乎由所有細胞類型分泌，并廣泛存在于各種生物體液中[9]。研究顯示[10]人類OA關節軟骨源的外泌體大小在50～250 nm，并主要富集于鈣化軟骨和軟骨下骨區域，與堿性磷酸酶活性增加相關。它們體內不僅含有病理性鈣晶體，還含有低表達的蛋白多糖及各種修飾后的蛋白質。用OA滑膜液(synovial fluid，SF)源的外泌體作用于軟骨細胞后，研究[11]顯示它們容易被軟骨細胞內吞，提示外泌體在OA中潛在一定特異性。在12例OA和非OA患者滑膜液中,發現兩組外泌體的大小(OA：0.128 μm、非OA：0.127 μm)和濃度(OA：1.18×1013/L、非OA：1.59×1013/L)無顯著統計學意義[11]，但兩組間外泌體的miRNA含量有所不同[12]，進一步對其內容物分析發現miR-200c顯著增加[12]。已知外泌體的內容物不受內切酶的影響，提示OA外泌體的特異性由其內的miRNA等體現的，因此對外泌體源miRNA更深入的探索將有助于解析其是如何參與或調控OA的病理生理。

2 外泌體作為OA潛在診療價值的研究進展

2.1 外泌體與OA病理的相關性

2.1.1軟骨及滑膜：OA的發病機制復雜且受多種因素影響[13]。首先，健康關節軟骨依賴于軟骨細胞和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的維持。軟骨細胞負責合成聚集蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)，后者進一步轉化為關節軟骨。ECM主要由Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖組成，而后者主要由ACAN組成，ECM的合成和破壞是維持關節軟骨的重要基礎。其次，關節內另外一個重要的組織是滑膜，滑膜由滑膜巨噬細胞和滑膜成纖維細胞[又稱成纖維滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)]組成，主要負責分泌潤滑軟骨的關節液。這些不同組織或細胞以外泌體為橋梁從而維持關節內環境平衡或介導OA的發生發展[14]。體外研究發現[15]白介素(IL)-1β所處理的軟骨細胞源外泌體會作用于FLS，相較對照組顯著增加基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13的表達，同時滑膜上腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β和環氧化酶-2(COX-2)的數量也有不同程度的升高，提示外泌體在OA的炎癥過程中起著重要作用。Kato等[16]在FLS與關節軟骨細胞之間進行外泌體研究，發現用IL-1β刺激人FLS源外泌體(實驗組)在體外實驗和體內模型中可以誘導軟骨細胞OA樣改變，與FLS源外泌體相比，實驗組可顯著上調軟骨細胞MMP-13和血小板反應蛋白解聚素金屬蛋白酶5(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondinmotifs 5，ADAMTS-5)的表達，并下調Ⅱ型膠原纖維α1基因(COL2A1)和ACAN的表達[16]，提示在FLS與軟骨細胞之間存在著與外泌體相關的正反饋炎癥通路。此外，實驗組含有大量的MMP-3、IL-6及血管內皮生長因子，將該外泌體作用于小鼠股骨軟骨移植組織，與對照組相比其所誘導的ACAN及血管生成數量更多[16]，通過NanoString分析顯示有50種miRNA表達水平存在差異[16]，提示血管的生成可能由FLS刺激軟骨基因的表達產生，因此外泌體內miRNA在OA中可能扮演傳遞通路的角色。進一步分析miRNA差異表達譜發現，IL-1β處理的FLS總共有340種miRNA被上調，而在FLS源外泌體中僅發現11種miRNA被上調，這一研究顯示FLS對包裝進入外泌體的miRNA具有一定的選擇性[16]。值得注意的是，在FLS源外泌體所上調的11種miRNA中，只有5種在FLS內也被上調[16]，分別是miR-4454、miR-720、miR-199b、miR-500B和miR-3154，其中對前三者的研究較為深入。miR-4454參與促進了軟骨細胞炎癥[17]，miR-720能促進細胞遷移[18]，miR-199b在軟骨形成過程中增加，而在間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)衰老過程中減少[19]。以上研究顯示外泌體中的miRNA不僅在細胞內發揮調節分子的作用，而且可能影響血管新生進而參與OA的發生發展。

2.1.2滑液：在OA的病理條件下，滑膜組織會產生大量的炎癥細胞因子、MMP等破壞關節軟骨，進而加速骨性關節炎的發展，而滑液在一定程度上又反映滑膜炎癥，因此通過對滑液內容物的研究可能進一步揭示骨性關節炎的病理。Domenis等[20]發現用終末期OA患者滑液源外泌體可以促進外周血單核細胞分化的促炎性M1巨噬細胞產生一系列炎癥細胞因子、MMP和趨化因子(CCL)，并認為這是關節軟骨炎癥及退化的重要因素。Kolhe等[12]也做了類似的試驗，發現外泌體所處理組顯著降低了關節軟骨細胞合成代謝基因(COL2A1、ACAN)的表達，升高了分解代謝和炎癥基因(IL-6、TNF-α)的表達，這些研究均表明外泌體在OA的發病中發揮重要作用。此外，他們還發現OA患者滑液外泌體miRNA含量的變化具有性別特異性，女性OA組比男性受到更多miRNA差異調節，兩種性別中下調miRNA顯示與聚糖降解、細胞粘附分子和黏蛋白型O-聚糖生物合成有關，上調miRNA則與甲狀腺激素合成、生物素代謝和苯丙胺成癮信號傳導有關[12]。其中某些miRNAs，如女性骨關節炎患者所下調miR-26a，是雌激素響應性的。與以往的研究相近，雌激素可增加靶向toll樣受體TLR3的miR-26a的表達，其雌激素抑制劑可抑制FLS中miR-26a[12]。在OA中，女性的發病率高于男性，其外泌體中的miRNA可能是性別差異發病機制的重要部分。

2.2 外泌體作為OA生物標志物的潛在價值

細胞產生的外泌體可以釋放到細胞外(如血液或體液)，它們可以反映親代細胞的生理或病理狀況，并作為不同疾病或疾病不同階段的潛在生物標志物[21]。

研究[22]顯示關節滑膜炎癥可能是OA的超早期表現，其發展可能影響OA的進展，從OA滑液中分離的外泌體可刺激巨噬細胞釋放一系列的炎癥細胞因子和CCL，包括IL-1β、MMP7、MMP12、CCL8、CCL15、CCL20等，其中IL-1β在OA滑膜液中明顯升高[20]，有利于其成為生物標志物，而MMP12和MMP7又與OA的嚴重程度有關[23-24]，對外泌體源MMP的檢測可在一定程度上反映OA的進展。此外，在OA的病理條件下，OA滑液外泌體的miR-200c含量較對照組增加2.5倍[16]，提示其可成為潛在生物標志物。在最近的一項研究中，Zhao等[25]將OA患者的血漿和滑液外泌體的lncRNA進行差異基因表達分析后發現，對于血漿樣品，所設定三組間(早期OA組、晚期OA組、對照組)外泌體lncRNA的表達沒有顯著統計學意義；而在滑液組中，其外泌體lncRNA PCGEM 1的表達不僅在OA患者與正常人之間存在差異，而且在OA的不同階段也有顯著差異，由于WOMAC指數與外泌體lncRNA PCGEM 1的表達密切相關并且ROC曲線下面積為0.879，提示滑液外泌體lncRNA PCGEM1可能是區分早期OA和晚期OA的有力指標。

Tsuno等[26]比較了類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)、OA患者及健康捐獻者血清外泌體的蛋白質譜，結果顯示在204個蛋白質斑點中，OA較健康對照組有21個蛋白質點顯示出不同的強度，其中有7個的強度差異具有統計學意義。進一步研究顯示與RA組相比，ID236(組織蛋白酶F)僅在OA組升高，而ID 325(Igα-2鏈C區)僅在OA組降低。據報道[27-28]，其家族中另一個成員(組織蛋白酶K)參與OA的發病機制并可作為OA潛在生物標志物，提示組織蛋白酶F可能參與OA的發生發展并有望成為OA外周血液中潛在分子標志物。

2.3 外泌體作為OA治療的潛在價值

隨著精準醫療的提倡，干細胞尤其是MSC療法備受青睞。研究顯示MSC可以通過抗炎、調節免疫、促進組織修復再生等發揮治療作用，但對其作用的方式卻各抒己見，沒有一種單一因素能自圓其說。近年來，越來越多的報道表明外泌體可作為MSC旁分泌機制在OA治療中發揮重要作用[29-30]。目前MSC來源外泌體(MSC-derived Exos，MSC-Exos)的研究大多集中于OA的治療，動物關節內所注射MSC-Exos可以減輕炎癥并修復軟骨組織。

Cosenza等[31]將鼠骨髓源MSC-Exos注入膠原酶誘導的OA模型中，發現其可以保護小鼠關節免受損傷，在第42天時，組織切片顯示關節軟骨中所有參數[體積、厚度、軟骨退化(表面/體積比)]顯著改善，且外觀與健康小鼠相比沒有明顯差異。體外實驗顯示這一效應與CD4+和CD8+T淋巴細胞的抑制、B淋巴細胞的活化以及誘導M2樣抗炎巨噬細胞的表達有關，而體內研究顯示與漿母細胞數量減少和分泌IL-10的Breg細胞增加有關。Zhang等[32]的研究顯示在免疫活性大鼠股骨遠端軟骨缺損模型中，關節內注射人胚胎MSC-Exos可以促進軟骨再生。在這項研究中，注射的外泌體加速了新組織填充和增強了II型膠原及糖胺聚糖的合成，到12周時，外泌體處理的實驗組不僅較磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)處理的對照組的組織學評分顯著改善，而且其表面的軟骨和軟骨下骨完全恢復并觀察到與年齡相匹配的天然組相似的ECM沉積。盡管該研究沒有進一步驗證外泌體的具體作用，但它證明了MSC-Exos在體內具有促進軟骨修復的作用。Wang等[33]進行類似研究，發現關節內注射人胚胎干細胞誘導的MSC-Exos(embryonic stem cell-derived MSC-Exos，ESC-MSC-Exos)減輕了DMM小鼠模型中軟骨破壞和基質降解。到術后8周時，組織學結果顯示注射PBS對照組的DMM小鼠有嚴重的纖維化和鈣化軟骨的侵蝕，而ESC-MSC-Exos組小鼠的纖維化較少，僅向淺層下方有垂直裂縫及少許表面層丟失，并且其最大和總OARSI評分均顯著低于對照組。進一步的體外實驗顯示，這種效應與Ⅱ型膠原合成增加及ADAMTS5的表達降低有關。這些研究都證明了外泌體可以修復動物關節軟骨，同時MSC-Exos可作為無細胞療法治療OA。

Zhu等[30]比較了滑膜MSC-exos(synovial membrane-derived MSC-Exos，SMMSC-Exos)和誘導多能干細胞來源MSC-exos(induced pluripotent stem-derived MSC-Exos，iMSC-Exos)對OA治療的有效性，發現注射SMMSC-Exos和iMSC-Exos均能在膠原酶誘導的小鼠OA模型中減弱OA，但iMSC-Exos的治療效果更優，因此iMSC-Exos可能代表了一種新型OA治療方法。

目前修飾后的外泌體在OA治療中也備受關注，miR-140-5p對MSC的軟骨分化至關重要，通過基因分析顯示SMMSC-140-Exos是miR-140-5p在SMMSC中過表達產生的一種改良外泌體，其可促進軟骨細胞的增殖和遷移，但對細胞外基質分泌的影響很小，并可預防大鼠模型發生OA變[34]。Sun等[35]對人骨髓間充質干細胞源外泌體(human bone marrow-derived MSC-Exos，hBMSC-Exos)中miRNA的差異表達分析發現，過表達miR-320c的hBMSC-Exos可促進軟骨細胞增殖從而發揮治療OA的作用，體外實驗顯示其作用與SOX9的上調及MMP-13下調表達有關。目前的研究顯示，各種MSC-Exos或修飾后的外泌體均可促進軟骨細胞的增殖從而發揮治療OA的作用，但其具體作用機制尚未明確，進一步的探索有利于為OA的精準治療提供新策略。

3 結論與展望

OA的病理涉及軟骨、軟骨下骨及滑膜等組織，外泌體可作為它們的樞紐發揮傳遞通路的作用，滑液或滑膜成纖維細胞源外泌體可誘導OA的進展，血清及滑液源外泌體有助于OA的診斷，不同來源MSC-Exos可通過增加軟骨細胞增殖、抑制炎癥等修復關節或延緩疾病進展。誠然，外泌體的這些作用將極大促進OA機制、診斷及治療方面的研究，但同時也存在一些難題。首先，外泌體中含有大量的蛋白質及非編碼RNA等，雖然它們參與或調控OA的發生發展，但難以準確找到有貢獻的分子，因此未來的研究可側重于某單一成分的功能剖析及它們之間的相互作用網絡；其次，無論是MSC-Exos還是修飾后的外泌體，都只作用于小型動物體內且具體的機制仍未闡明，因此它們在體內的安全性和有效性仍需要進一步觀察與研究，將來可在大型動物體內進一步驗證?？傊?，挑戰依然存在，但外泌體對于OA的診療作用已顯示出巨大潛力，對其進行深入研究必將產生重大影響。