Hedgehog信號通路抑制因子SUFU在腫瘤中的作用機制研究進展

林曉敏 綜述 謝思明 審校

暨南大學口腔醫學院，廣東 廣州 510632

刺猬信號通路Hedgehog(Hh)信號通路在胚胎和組織發育中起重要作用[1-2]，其異常激活可能與人類多種惡性腫瘤相關，如卵巢癌[3]、口腔鱗狀細胞癌[4]、肺癌[5]等。Hh信號通路通過Hh配體與十二次跨膜受體Patched1(Ptch1)的相互作用而啟動，減輕了Ptch1對G蛋白偶聯受體smoothened(Smo)的抑制作用。這種相互作用觸發了膠質瘤相關癌基因同源物(Gli)的激活，激發Hh靶基因的轉錄[6]。而絲氨酸/蘇氨酸激酶Fused抑制因子(Sufu)通過與Gli相互作用并抑制Gli來抑制Hh信號通路。本文就Sufu在腫瘤中的研究進展，主要是針對Sufu調控Gli的機制，以及Sufu蛋白自身的調控研究進行綜述，為基于Sufu為靶點的治療方法提供了相關參考信息。

1 腫瘤中的Hh信號通路

目前研究認為，不同腫瘤類型中異常Hh信號激活可能存在三種機制[7]。一種是不依賴配體的信號傳導，即通路成分突變導致的Hh信號通路異常激活。常見的有Ptch1基因突變引起的痣樣基底細胞癌綜合征(nevoid basal cell carcinoma syndrome，NBCCS)[8]，罕見的，肌肉腫瘤橫紋肌肉瘤中也發現了Ptch1和Sufu突變[9]。另外兩種為依賴配體的自/近分泌信號和依賴配體的旁分泌信號。哺乳動物分泌三種Hh配體(SHh、IHh、DHh)，SHh配體蛋白通過自分泌(與分泌它的腫瘤細胞結合)或旁分泌(由腫瘤細胞分泌，與附近的基質細胞結合或由基質細胞分泌并被腫瘤細胞吸收)的方式，誘導細胞合成和分泌信號因子以激活Hh信號通路。其傳導過程如下：功能性SHh配體表達時，SHh與Ptch1結合，解除Ptch1對Smo的抑制，激活的Smo轉移至原纖毛(primary cilium，PC)中，通過某種機制(可能涉及將Gli與Sufu的抑制性復合物解離)在細胞膜上轉導Hh信號以激活Gli[6]，最后，激活的Gli進入細胞核轉錄激活一組特定基因，促進腫瘤生長和侵襲。而這便是SHh經典信號通路途徑，后面將簡單稱之為Hh通路。Ptch1抑制Smo的機制以及Sufu調節Hh信號通路的機制仍不清楚。

2 Hh信號通路中的Sufu

2.1 Sufu在調控Hh信號通路中起關鍵作用 Sufu基因首先在果蠅中被鑒定，然而哺乳動物中Sufu表現出更為重要的負調控作用。轉基因小鼠實驗中，敲除Sufu等位基因可導致胚胎死亡，并伴隨嚴重的背部開放性神經管缺損；Sufu+/-雜合子小鼠也出現Hh信號傳導增強，且與敲除Ptch1表現的表型一樣嚴重[10]；Sufu+/-p53-/-小鼠個體也可發現與Ptc1+/-小鼠相似的髓母細胞瘤(medulloblastoma，MB)和橫紋肌肉瘤[11]，但單獨p53基因的缺失小鼠并不會產生上述結果。這些實驗提示Sufu缺失對腫瘤的發生與發展具有一定的促進作用。此外，Sufu突變可引起經典的NBCCS，且其患MB的風險是Ptch1突變個體的20倍高[12]。NBCCS某些表型特征，如手掌硬化性纖維瘤特征[13]、漏斗型囊性基底細胞癌[14]等在具有Sufu突變的個體或家庭中更為普遍。生殖系Sufu突變導致的MB常發生在3歲以下的患者中，其預后通常比普通SHh MB者差[15]。王美等[16]研究發現Sufu的突變可以促進MB，其細胞實驗也證實了Sufu通過結合Gli蛋白從而抑制其功能。皮膚錯構瘤[17]中也發現了Sufu相關基因的突變。綜上所述，無論Hh配體存在與否，Sufu蛋白的失活都足以激活Hh信號通路，與多種人類腫瘤密切相關。這與Sufu在Hh信號通路中起關鍵抑制作用是相符合的。然而，有研究發現Hh誘導的Gli轉錄激活可能獨立于Sufu而發生，Sufu的活性降低可以減少Hh對高閾值神經管凋亡的誘導[18]。這提示Sufu可能在Hh信號通路中還存在正向調節作用。YIN等[19]最近證明了Sufu通過維持強大的Gli活性，在Smo激活的MB中起促腫瘤作用，確立了Sufu在SHh MB中的雙重作用。這些研究提示Sufu在腫瘤中的生物學功能可能存在兩面性。

2.2 Sufu調節Gli機制 大量研究揭示Sufu通過多種機制調節Gli(鋅指蛋白Gli1、Gli2和Gli3)的轉錄活性，抑制Hh信號傳導。但Sufu調控Hh信號通路的機制仍存在爭議，這一直是這個領域的研究熱點。細胞質中，Sufu通過結合Gli阻止Gli蛋白進入細胞核，最終調節Hh通路活性。研究發現，Sufu與核轉運受體蛋白importinβ1競爭結合Gli1的相同位點，阻礙importinβ1介導的Gli1的核易位[20]。Sufu和importinβ1的相對細胞內濃度可能決定Gli1的定位，從而影響其在腫瘤以及發育系統中的作用。Sufu還通過掩蓋Gli的核定位序列，阻礙由核蛋白β2(karyopherinβ2)介導的Gli2/3的核積累[21]。Sufu在細胞質中調控Gli過程如圖1[22]。沒有功能性Hh配體時，PC相關驅動蛋白(Kif7)、Sufu和全長Gli2/3組成胞質蛋白復合物。該復合物被蛋白激酶A(PKA)、糖原合酶激酶3(GSK3)和酪蛋白激酶1(CK1)磷酸化，隨后高磷酸化的全長Gli2/3蛋白經SCF(Slimb/β-TrCP)泛素連接酶介導而部分降解，截短了C端轉錄激活域，水解為Gli阻遏物(GliR)。GliR移動至細胞核內與全長的GLI2/3競爭相同的調節序列，抑制了Hh靶基因表達。當Hh配體表達時，激活的Smo使得Sufu-Gli復合物募集到PC末端，隨后復合物快速解離，釋放出全長Gli2/3。Gli2/3作為Gli激活劑(GliA)取代GliR進入細胞核，與靶基因啟動子結合，并激活Hh靶基因的轉錄。最近有實驗顯示，Sufu是一個胞質穿梭蛋白，Sufu伴隨著GliA和GliR進入細胞核[23]，可能促進GliA迅速從細胞核中輸出。細胞核內，Sufu可與DNA分子中的Gli結合序列結合并阻止基因轉錄，還能通過招募SAP18-mSin3-HDAC轉錄共抑制復合物來抑制Gli的轉錄活性[24]。此外，CHUWEN等[25]發現Sufu還可以募集p66β(核小體重構和組蛋白脫乙酰基酶NuRD的阻遏物復合物的成員)來阻斷Gli介導的Hh靶基因表達。而Hh途徑激活導致Sufu/p66β與Gli分離，促進Gli蛋白活性。Sufu對Gli的綜合調控主要靠調控GliR和GliA的濃度比值，以維持梯度Hh通路活性[26]，這對于實現多細胞生物中Hh通路的復雜生理功能至關重要。還有研究發現，細胞核內Sufu的定位與Gli蛋白有關，Sufu在核內的穩定性受Gli蛋白家族成員調控[27]。這表明，Sufu本身活性也受到Hh信號調控，進而控制靶基因的表達。Sufu是Hh通路中最保守的成分之一,Sufu與Gli蛋白的物理解離是Hh通路激活的主要特征。因而，對Sufu蛋白結構的探索，有助于解釋Sufu和Gli之間的物理相互作用。Sufu蛋白晶體單體由兩個球狀域組成，即NTD(氨基末端域)和CTD(羧基末端域)，兩者之間有一個短的連接子。有文獻報道，細胞質中Sufu可以通過其NTD來束縛的Gli蛋白，而細胞核中，則通過其CTD抑制Gli[28]。Sufu蛋白的兩個結構域采取β片疊加的方式將Gli夾在中間，呈現出封閉構象[29]。Hh激活誘導Sufu由封閉轉變為開放構象，導致Sufu與Gli蛋白SYGHL序列之間的相互作用降低，具體的機制尚不清楚。王美等[16]發現突變位點R146X、R299X、R430X3處的Sufu突變體破壞了和Gli的結合，這為深入了解Sufu結構的改變影響其功能提供了條件。可見，Sufu與Gli結合界面在Sufu調控Gli中起著至關重要的作用，介導結合界面的關鍵氨基酸殘基突變可以破壞Sufu-Gli蛋白之間的相互作用從而調控Hh信號通路，值得未來深入研究。綜上所述，Sufu參與調節Gli蛋白以及Hh信號從細胞質到細胞核的轉導，通過調節Gli的亞細胞定位和穩定性，實現Gli蛋白在Hh信號梯度下的分級活性。這些復雜的調控依靠Sufu與Gli之間的物理相互作用以及其他因素共同作用。

3 Sufu蛋白活性的調節

相較于Sufu在調控Gli方面的較廣泛的研究，Sufu蛋白自身活性的調控仍較模糊。近來研究發現，翻譯后修飾將影響Sufu蛋白的穩定，從而影響腫瘤的發生發展。

Hh通路激活能誘導Sufu多聚泛素化，使Sufu隨后被蛋白酶降解失去穩定性，這可能促進了腫瘤的發生。最近的一項研究表明，MB中E3泛素連接酶SCF(Skp1-Cul1-F-box)蛋白Fbxl17(F-box和富含亮氨酸的重復蛋白17)在細胞核中能夠靶向的Sufu蛋白水解，使Gli1從Sufu-Gli1復合物中釋放出來以進行適當的Hh信號轉導，促進MB的形成[30]。這表明，泛素-蛋白酶途徑介導的降解對Sufu在翻譯后水平的調控具有重要意義。同樣的，磷酸化也在調節Sufu穩定性中起重要作用。與泛素化作用相反，糖原合成酶激酶-3(GSK3 β)、環 磷 酸 腺 苷 (cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、PKA等引起的Sufu磷酸化，可促進其穩定化。當Hh通路激活時，Sufu被轉運出PC并通過蛋白酶途徑降解。PKA和GSK3β在Ser-346和Ser-342處的雙重磷酸化可以延長Sufu在PC中的停留時間并穩定蛋白質[31]。廖恒青等[32]研究發現Sufu發生磷酸化修飾后對MB的抑制作用增強而非磷酸化的Sufu突變體抑癌作用明顯減弱，該研究還認為磷酸化Sufu主要聚集在細胞核。WANG等[33]通過酵母雙雜交實驗篩選鑒定了絲氨酸/蘇氨酸激酶Nek2A是一種與Sufu相互作用的蛋白酶。該酶可以在細胞質中磷酸化并穩定Sufu，從而抑制Hh/Gli2信號通路。上述實驗證實了泛素化使Sufu失穩而磷酸化穩定Sufu的作用。然而，INFANTE等[34]最近提出了泛素化對Sufu調節的新機制，他們在MB中發現具有HECT(與E6相關的蛋白質羧基末端）結構域的E3泛素連接酶Itch，它與銜接蛋白β-arrestin2的復合物可以結合Sufu，促進Sufu的K63連接泛素化。但該過程并不會影響Sufu的穩定性，反而促進Sufu-Gli3復合物的形成，增加Gli3R的量，阻斷Hh通路。這證明Itch介導的Sufu泛素化能抵抗MB腫瘤形成。該研究還發現Sufu的突變體則對Itch介導的泛素化不敏感，能刺激MB發病。

上述研究結果表明，磷酸化和泛素化等翻譯后修飾的過程，很可能復雜精密地調節Sufu蛋白的穩定性，影響其腫瘤調控作用。目前還需要更多的研究來揭示其他的調控和它們之間的關系。

除了翻譯后修飾，許多外泌體也能影響Sufu蛋白表達活性從而調節腫瘤的生長。早前有研究發現，miR-378可以通過減弱Sufu和TUSC2(腫瘤抑制因子候選基因2)的翻譯來促進細胞存活、腫瘤生長和血管生成[35]。miR-214可以直接靶向Sufu mRNA并破壞其功能，從而促進肺腺癌的上皮-間質轉化(EMT)和轉移[36]。近期在乳腺癌中還發現其他調節因子，如lncRNA GAS5(長鏈非編碼RNA生長停滯特異性轉錄本5)通過靶向miR-378a-5p/Sufu信號傳導促進三陰性乳腺癌細胞凋亡[37]。LIFR-AS1(白血病抑制因子受體反義RNA1)與miR-197-3p競爭結合而上調Sufu，抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移[38]。miR-423-5p[39]、miR-224[40]、14-3-3ζ(調節蛋白)[23]近期也被發現與Sufu共同作用調控胃癌、膀胱癌、宮頸癌的癌細胞增殖和遷移以及腫瘤生長和轉移。然而各類外泌體對Sufu具體的調控機制尚不明確，以Sufu自身為核心的調控體系仍需不斷探索。

4 展望

Hh信號傳導異常涉及多種人類惡性腫瘤的發生與發展，盡管已有許多相關研究，通路級聯內的機制仍然難以捉摸。目前Hh信號通路在腫瘤治療方面的研究主要是Smo抑制劑[41-42]的開發，這對通路下游基因突變以及Hh信號非經典傳導途徑形成的腫瘤有較大的局限性。本文綜述了Sufu對腫瘤中Hh信號通路的影響以及Sufu調控Hh信號通路的機制，還討論了Sufu蛋白自身活性的調控。確定了Sufu-Gli復合體在Hh通路中重要的地位，并從多方面解析了Sufu對腫瘤的調控作用。為基于Sufu為靶點的治療方法提供了相關參考信息。