腦卒中后抑郁中醫病證結合動物模型的思考

邵樂，焦欣，劉林，佘顏*

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

腦卒中是嚴重危害人類生命健康的重大心腦血管疾病之一，數據表明，全世界每年新增腦卒中患者約1 690萬人[1]。腦卒中患者極易并發抑郁癥，也是腦卒中后最常見的并發癥。腦卒中后抑郁(post-stroke-depression，PSD)屬于中醫中風合并郁證的范疇，其發病率高達38%，抑郁使得腦卒中患者存活率下降51%，為影響患者康復、甚至輕生的第一大元兇，是全球面臨的一大難題[2]。中醫藥通過辨證論治，采用中藥復方可多成分多途徑多靶點治療PSD，而建立與臨床中醫辨證分型相符的PSD動物模型對于開展其基礎研究具有重要意義。目前PSD造模為采用腦卒中模型復合抑郁模型而成，現將PSD中醫病證結合動物模型的造模方法和相關思考闡述如下。

1 實驗動物

目前PSD模型的動物造模主要采用大鼠及小鼠，常用Wistar大鼠[3-4]、Sprague-Dawley大鼠[5]及C57BL/6J小鼠[6-7]、balb/c小鼠[8]，ICR小鼠[9]、Laca小鼠[10]，其中SD大鼠和C57BL/6J小鼠在PSD模型造模中最為普遍，其中Wistar大鼠對應激敏感[11]，SD大鼠具有遺傳抑郁[12]。雌激素對腦血管具有保護作用[13]，故較少使用雌性動物而多采用雄性動物。

2 腦卒中中醫病證結合模型

2.1 氣虛血瘀證

氣虛血瘀為缺血性腦卒中的基本病機，“氣為血之帥，血為氣之母”，氣虛則無力推動血液運行，導致血瘀出現，氣虛日久，必然導致血瘀出現，王鍵[14]等根據中醫“人過四十，陰氣自半”“饑則損氣”“胃不和則臥不安”“勞則耗氣”“濕傷脾，寒傷腎”“憂思傷脾，驚恐傷腎”“肥甘厚味易致高粱之疾”理論，采用“游泳+饑餓+寒濕+中年+高脂飲食”模擬氣虛血瘀模型后行動脈夾夾閉雙側頸總動脈，3h后松開恢復血流。劉超明[15]等根據“勞則氣耗”中醫理論，采用持續力竭性游泳法，氣耗日久必氣虛，氣虛則行血之力不足，血行漸緩久之成瘀，再合并大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血再灌注(MCAO-R)模型制成腦卒中氣虛血瘀型證大鼠模型。譚輝[16]等根據“氣為血之帥”理論，結合低氧環境模擬不能吸入足夠“自然界清氣”，宗氣不能生成，采用饑餓、疲勞、低氧、肥甘厚味因素模擬氣虛血瘀證合并線栓法制作MCAO-R氣虛血瘀大鼠模型。王健[17]等運用大黃瀉下法合并MCAO建立氣虛血瘀證腦缺血再灌注大鼠模型。模型評價指標[18]以大鼠腦缺血表現及體征為精神萎靡，雙眼淺紅、微睜、無神，自主活動少，外界刺激反應遲鈍，舌質呈暗紫色、毛發粗糙易掉等癥狀即造模成功。

2.2 腎虛證

腎為先天之本，腎藏精，上通于腦，腦為髓海，“人始生成精，精成而腦髓生”，國內學者依據以上理論，建構腎虛型腦缺血大鼠模型。張雨薇等[19]根據缺血性腦血管病的發生與“腎精虧虛”密切相關，制備pMCAO大鼠模型后每日肌注氫化可的松注射液15 mg/kg制備腎陽虛腦缺血大鼠模型，造模評價指標以其除腦缺血癥狀外，出現活動減少、畏寒喜暖、弓背蜷縮、食欲降低、遲鈍、四肢消瘦、脫毛、多尿及體質量降低等即為造模成功。劉宏等[20]根據“腎通于腦”及“恐傷腎”理論，在MCAO手術前，用“貓嚇鼠”法，以活鼠喂貓示眾，增加恐嚇氛圍，建立腎虛模型或采用雙側性腺摘除法制備腎虛模型，評價以方測證判斷其為腎虛模型造模成功。

2.3 痰瘀互結證

脾為生痰之源，脾失健運，聚濕成痰，痰濁內生，痰瘀互結，壅滯經脈，上蒙清竅，發為中風。張令霖等[21]采用高脂飼料喂養結合大腦中動脈栓塞法制作痰瘀互結腦缺血再灌注大鼠模型，通過高脂、高糖、高蛋白飼料喂養，形成動脈粥樣硬化病理特點模擬“痰”證，MCAO法模擬“瘀”證，評價以出現肢體偏癱，眼瞼下垂，舌苔厚膩，舌質紫暗等表現及血脂升高表明造模成功。劉抒雯等[22]采用脂肪乳劑灌胃合并線栓法制作痰瘀互結證腦缺血大鼠模型，以大鼠一般情況及血液流變學、血脂指標進行驗證其造模成功。

2.4 火熱證

火熱證是《中風病辨證診斷標準》依據中風病臨床癥狀量化診斷研究分出的風證、火熱證、痰濕證、血瘀證、氣虛證及陰虛陽亢證六大證候之一，火毒證動物模型符合臨床火熱證型，采用腹腔注射角叉菜膠復合MCAO建立急性腦梗死火毒證大鼠模型[23-24]，以爪甲腫脹紅紫、尾部血栓明顯，出現黑尾現象、耳廓邊緣發紅、舌底脈絡青紫粗長以及細絡瘀血、肛溫增高、體重無明顯下降為火毒證模型納入實驗。瘀血阻絡為腦缺血的根本病因，瘀熱證亦屬火熱證，蔣寶平等[25]采用間隔24 h，分2次給予LPS，每次50 μg/kg，第二次給予LPS后2 h，再合并MCAO復制瘀熱證，采用炎癥因子及血液流變學的變化以驗證模型。

3 抑郁中醫病證結合模型

包祖曉[26]等采用注射利血平和氫化可的松建立肝腎陽虛型抑郁癥病證結合模型，依據利血平為制作陽氣虧虛證常用模型，糖皮質激素模型為制作腎陽虛證經典動物模型，且均可出現類似抑郁癥病理變化制作肝腎陽虛型抑郁癥模型。采用一般四診指標及四診計量化檢測與計量辨證方法檢測大鼠陽熱、氣虛、陰虛、血虛程度評價驗證模型。

4 PSD造模方法及評價

PSD基本病因為“瘀”“郁”，其中醫病證結合模型文獻報道較少，可采用腦缺血中醫病證模型合并抑郁模型制作而成，PSD造模多在腦缺血模型的基礎上采用以下方法。

4.1 PSD造模方法

4.1.1 慢性溫和不可預知應激(CUMS)合并孤養法

CUMS合并孤養法是目前國內外常用的PSD造模方法，CUMS模式作為經典的抑郁模型制備方法，可模仿臨床病人在日常生活中遇到的物理生理刺激，導致其快感缺失以及對各種外界刺激反應降低等核心癥狀，其具有高度有效性、穩定性，基本符合抑郁模型要求，但造模過程較為復雜，工作量較大。主要采取禁食24 h，禁飲18～24 h，晝夜顛倒、冰水游泳(4 ℃，5～6 min)，夾尾(1～2 min)，籠傾斜(40°～45°，15～24 h)等[27]。孤養法采用單籠飼養，其模擬抑郁性障礙的孤獨，社會隔離，社會交往減少及異常。

4.1.2 束縛應激法

在腦卒中術后1周，將動物置于體積限制、通風良好的圓柱體塑料管內，或將大鼠限制在束縛架上，2 h 1次/d，持續1～2周，予以每日2 h的行為限制，其通過嚴格限制動物活動而誘發類似人類抑郁障礙的核心癥狀,屬于不可逃避性或強制性心理應激模型[28]。

4.1.3 懸尾和強迫游泳實驗

卒中造模后每天進行強迫游泳和懸尾應激，強迫游泳實驗[29]：將動物放入一定水深的桶內，水溫(25±2)℃。實驗前預測6 min,選取靜止不動時間70～160 s的動物實驗用。游泳時間為6 min,累計后4 min內的不動時間。不動時間是指小鼠在水中停止掙扎,或呈漂浮狀態,僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面的持續時間；懸尾實驗[29]：將動物尾部距末端用夾子固定,倒懸于的箱內，懸掛時間為6 min,累計后4 min內的不動時間。其屬于絕望模型，可誘導抑郁，亦可作為抑郁評價指標，造模方法簡單，易于觀察。

4.1.4 利血平法

卒中后合并孤養加利血平法法制備PSD模型，采用腹腔注射利血平0.2 mg/kg，每日1次，共14 d[30]。利血平可引起抑郁樣癥狀，其造模時間短，機理明確，可使腦中生物胺(去甲腎上腺素、5-HT、多巴胺) 耗竭，誘導大鼠及小鼠體溫降低、眼瞼下垂、腹瀉、運動能力下降等現象，抑郁藥理學模型的首選，可用于藥物篩選[31]。

4.2 PSD模型評價

4.2.1 神經功能評價

卒中后神經功能主要采用Longa 5分法[32]、Bederson5分法[33]等進行神經功能評價。Longa5分法：0分：沒有神經功能損傷癥狀；1分：左側肢體不能完全伸直；2分：行走不穩，向左側打轉；3分：站立不穩，行走時向左側傾斜；4分：意識昏迷。Bederson5分法：0分：無神經損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向癱瘓側轉圈；3分：向對側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失。

4.2.2 行為學評價

抑郁主要采用行為學檢查，糖水偏好實驗[34]檢測其快感缺失情況，可作為抑郁評價的金標準。曠場實驗、明暗穿梭實驗及Morris水迷宮測定[35]驗檢模型動物的活動情況，可檢測其焦慮樣行為；強迫游泳實驗及懸尾實驗檢測[29]動物絕望行為。具體方法如下：

①糖水偏好實驗：每籠兩瓶水，1瓶糖水，1瓶純水，記錄各自重量,24 h后再稱量剩余水重量。計算糖水偏好指數：糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

②曠場實驗：將鼠置于場箱底面的中心，用實時視頻圖像跟蹤分析系統記錄鼠在3～5 min內的活動情況。測試安排在暗室中，每次測定結束將排泄物清除干凈，每只僅測定1次。分析指標包括：移動距離、平均速度(不包含休息時間)。

③明暗穿梭實驗：把鼠放進穿梭箱內的任何一個空間，先進行主動回避反應訓練，20 s后開始出現燈光或和蜂鳴音，該刺激持續15 s，其中后10 s內再加上電刺激。最初動物只對電刺激出現反應，即逃至箱子對側空間躲避電擊。20 s后再次出現燈光或蜂鳴音，并同時在其所在側施加電刺激，迫使其跳至另一側，反復進行穿梭訓練，出現主動回避反應。記錄動物反應次數及受到刺激后穿梭到另一空間的時間。

④Morris水迷宮測定：適應性訓練后，將鼠置于逃生平臺，隨后將其放入離平臺最遠象限，開始計時，直至鼠登上逃生平臺后5 s停止計時，允許游泳時間為60 s。如此將鼠依次放入其余3個象限,分析指標包括：逃避潛伏期、軌跡(路徑)、總路程、總時間、平均速度、搜索策略、各象限游泳路程等。

⑤強迫游泳實驗及懸尾實驗同4.1.3實驗操作。

5 討論

辨證論治是中醫藥臨床治療疾病的優勢所在，而符合中醫病證結合的動物模型是中醫藥進行基礎研究的根本，其要求動物在復制疾病的模型時，必須考慮到相應的中醫證型。

綜上所述，目前PSD的造模以腦缺血模型復合抑郁模型而成，其中腦缺血病證結合模型以氣虛血瘀證、腎虛證、痰瘀互結證、火熱證最為常見，然而抑郁癥病證結合模型研究較少。根據現有抑郁造模方法分析CUMS合并孤養法、束縛應激法、懸尾和強迫游泳實驗均屬于情志不良所致肝失疏泄之肝氣郁結證，現代研究發現利血平法屬于陽氣虧虛證候類造模法，而中醫內科學教材將郁證的辨證分為肝氣郁結、氣郁化火、血行郁滯、痰氣郁結、心神惑亂、心脾兩虛、心陰虧虛及肝陰虧虛，除肝氣郁結證外，其余證型的抑郁中醫病證結合模型研究少見。但是，采用腦卒中病證結合模型復合抑郁模型建立PSD病證結合模型后仍難以保證其證型一致，也很有可能會發生改變。故應在PSD疾病模型已建立的基礎上復合中醫證型造模，是獲得PSD中醫病證結合動物模型的有效途徑，其具體研究方法還有待進一步探討與驗證。因此，建立穩定、可重復、操作簡單的PSD中醫病證結合動物模型是進行中醫藥防治PSD基礎研究的當務之急，仍是廣大中醫藥專家和學者研究的重中之重。