蜜蜂腸道微生物研究進展

李家豪，馮啟理，韓日疇

(1. 華南師范大學生命科學學院，廣州 510631；2. 廣東省科學院動物研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室， 廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

蜜蜂作為一種經濟昆蟲，不僅釀造造福人類的蜜蜂產品，更為許多經濟作物傳粉，具有重要的經濟、生態價值(Gallaietal., 2009; Hroncovaetal., 2019)。全球蜜蜂數量的變化顯著影響經濟作物的產量和生態環境植被。動物腸道中的微生物群落可以幫助消化食物、解毒有害物質、提供必要的營養、防止病原體和寄生蟲入侵，調節發育和免疫，從而使宿主受益(Hamdietal., 2011)。可見微生物群與宿主的健康息息相關。當宿主體內的微生物群遭遇到某種因素的壓力，菌群會失調，并導致宿主生理功能無法正常運行，甚至死亡。許多西方國家遇到一種授粉危機，各地出現了大規模蜜蜂的不明原因死亡，稱為蜂群衰竭失調(Colony Collapse Disorder, CCD) (Genersch, 2010)。研究人員調查蜜蜂死亡的原因，發現這個現象可能是在環境壓力、蜜蜂飼料(花蜜和花粉)缺乏以及生物壓力協同作用下導致的(Khanetal., 2020)。此外，蜜蜂的腸道微生物菌群研究也是一個良好的模型。本文主要綜述了蜜蜂腸道菌群的組成、作用、影響因素以及研究方法，提出了存在的問題以及對未來研究的展望。

1 蜜蜂腸道菌群構成與特征

1.1 蜜蜂核心菌群及特征

蜜蜂體內存在大量的微生物，尤其是腸道體內的微生物與蜜蜂的生理活動密切相關，參與了花粉等物質的消化吸收，同時提高蜜蜂對病毒蟲害的抵抗能力(Cariveauetal., 2014)。目前研究人員通過傳統分離培養和16S r DNA 結合的方法發現在蜜蜂腸道存在5種核心菌群和4種含量相對較少的菌群(Donaldsonetal., 2016)。5種核心菌種包括2種革蘭氏陰性菌Snodgrassellaalvi(β-變形菌綱)和Gilliamellaapicola(γ-變形菌綱)(Kwongetal., 2013)，2個革蘭氏陽性的乳桿菌屬類群LactobacillusFirm-4、Firm-5 (Babendreieretal., 2007)以及雙歧桿菌Bifidobacterium(Bottacinietal., 2012)。其余的4個菌種Frischellaperrara，巴爾通體菌Bartonellaapis,Parasaccharibacterapium和葡糖桿菌Gluconobacter中特定的一個種類群“Alpha 2.1”雖然不會穩定大量地存在蜜蜂腸道中，但最近也證明了它們在腸道有嚴格的生態位(李晨伊等，2018)。

共生菌主要歸為九大類，分別是：Gamma-1(Gilliamellaapicola)、Gamma-2(Frischellaperrara)、Beta(Snodgrassellaalvi)、Alpha-1(Bartonellaapis)、Alpha-2.1、Alpha-2.2(Parasaccharibacterapium)、Bifidobacterium、Firm-4和Firm-5(Jeyaprakashetal., 2003; Babendreieretal., 2007; Moranetal., 2012)。其中Gamma-1、Beta、Firm-4和Firm-5在蜜蜂腸道中普遍性和豐度都較高(Babendreieretal., 2007；Martinsonetal., 2011；Powelletal., 2014)，Bifidobacterium盡管豐度低，但出現在所有正常蜜蜂腸道中(Bottacinietal., 2012)。因此Gamma-1、Beta、Firm-4、Firm-5和Bifidobacterium是蜜蜂腸道中最核心的5種優勢菌(王紅芳和胥保華，2020)。

東方蜜蜂Apiscerana、熊蜂Bombus及其他無刺蜂Meliponafasciculata具有和西方蜜蜂Apismellifera相似的腸道菌群屬和結構，但是也有其特殊的腸道菌，群落組成存在細微的差異，這些差異隨著季節、飲食、寄主年齡、種和地理位置的變化而變化(楊志波和張紹升, 2010; Guoetal., 2015; Kapheimetal., 2015)。西方蜜蜂的蜂王有一種Parasaccharibacterapium菌落明顯要豐富于擔任其他功能的蜜蜂，大多數不繁殖的工蜂幾乎沒有P.apium(Kapheimetal., 2015)。社會性蜜蜂的簡單微生物群表現出宿主特異性，蜜蜂腸道中的共生物種具有互補的能量代謝能力，這意味著它們在不同的生態位中占有一席之地。此外，不相關的腸道共生菌由于共同寄生于宿主腸道內還會發生基因的水平交換，而不同寄主的菌株已經分化，蜜蜂共生菌在進化和功能上與熊蜂不同，這表明腸道共生體可能是蜜蜂物種間生物差異的關鍵因素(Kwongetal., 2014b)。在西方蜜蜂中，腸道菌落的共生交換可能通過接觸行為或在同一朵花上覓食而發生。由數百個工蜂和一個蜂王組成的群體建立菌落的模式不會造成腸道細菌數量的瓶頸，也有利于保持菌株的多樣性。除了不同蜜蜂中腸道菌可能會不同外，即便是同一種蜜蜂中，群勢弱的蜂群的腸道細菌豐富度和多樣性明顯低于群勢強的蜂群，這些相對豐度的顯著差異并不是由單個蜂巢的影響造成的，而是作為一個明顯的微生物群特征出現的(Ribiereetal., 2019)。

蜜蜂腸道菌的功能豐富，如Gilliamellaapicola具有代謝甘露糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖的能力。Zheng等人(2016)從蜜蜂組織中測試的所有菌株至少可以利用其中的一種糖，這表明這些腸道共生菌株可能通過幫助消化難降解的碳水化合物來增加宿主的能量攝取(Zhengetal., 2016)，正如在其他昆蟲腸道和人類腸道中的細菌所觀察到的那樣。判斷一種細菌是否作為蜜蜂核心或非核心腸道細菌的地位十分困難。Lactobacilluskunkeei是蜜蜂腸道中最常見的細菌，也存在于純蜂蜜、花蜜和蜂糧中。然而，也有研究認為，L.kunkeei的大量存在是由于培養條件的不同，由于這些細菌在其他獨立培養的研究中不存在或很少，仍需要進一步的研究(Andersonetal., 2013)。

1.2 腸道菌群在不同腸道部位的分布

蜜蜂的腸道大致可分為蜜囊、中腸、幽門和后腸。乳酸桿菌菌群在蜜囊中占據優勢，與花蜜和蜂巢的菌群有很高的類似性，因此這些菌群被認為是來自花蜜，并非是腸道內的共生菌(Vasquezetal., 2012; McFredericketal., 2017)。蜜蜂的最大消化器官是中腸，但是中腸的細菌數量很少，包含3種主要共生菌(即Beta、Firm-5和Gamma-1簡稱BFG)，所含的細菌大部分靠近幽門(張棋麟等，2019)。幽門中的細菌主要是非核心菌株Frischellaperrara(Emeryetal., 2017)。蜜蜂的后腸又可以分為2個獨立部分，即回腸和直腸。蜜蜂大部分的細菌都會聚集在腸道的深處，那些未被宿主消化的膳食化合物(如聚糖)積聚在蜜蜂的回腸和直腸，為微生物群提供主要的碳、氮來源(Flintetal., 2017)。回腸中主要包含Gilliamellaapicola和Snodgrassellaalvi兩類核心菌群，雖然回腸比中腸小，但是細菌數量遠高于中腸。回腸具有較深的內折以擴大了細菌的接觸面積來吸收未被中腸消化的營養。直腸有營養十分豐富的環境，因此棲息了絕大部分穩定的微生物，其中LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5和Bifidobacteriumasteroides是優勢菌種，主要位于腸腔當中(Martinsonetal., 2012; Kwongetal., 2017)。即便蜜蜂具有許多不同類型的微生物，但是腸道內部的多樣性比整個群體的多樣性要低得多(Ellegaard and Engel, 2019)。

1.3 蜜蜂不同發育階段的核心菌群變化

蜜蜂為全變態膜翅目社會性昆蟲，一生經歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個發育階段，每個發育階段都有顯著的發育特征(Remboldetal., 1980)。發育中的幼蟲在化蛹前有一個不連續的腸道(前腸和后腸沒有連接)，因此，這一階段的幼蟲是包括細菌或病毒在內的許多主要病原體的目標(Rauchetal., 2009; Blanchardetal., 2014)。蜜蜂的一生中，腸道菌群的變化會隨著蜜蜂不同發育階段的變化而變化，最后趨向于穩定。研究表明，無論是中華蜜蜂還是西方蜜蜂，新出生的蜜蜂和幼蟲腸道中幾乎沒有或沒有細菌(Martinsonetal., 2012; Guoetal., 2015)。中華蜜蜂幼蟲從5 d開始，其成年工蜂腸道中具有的4種細菌(Lactobacillus,S.alvi,Bifidobacterium,G.apicola)數量開始增加，隨后下降，并在其余時間保持穩定(Guoetal., 2015)。蜜蜂會通過蜂巢、孵化卵細胞或者是工蜂的社會接觸獲得腸道細菌(Martinsonetal., 2012)。當蜜蜂達到成年工蜂的年齡時，它們會面臨著充滿細菌的環境。對于中華蜜蜂，Lactobacillus會在第10天達到高峰(Guoetal., 2015)，在12～21 d期間，蜜蜂最重要的生理生化過程是參與食物生產，如花蜜和蜂糧的加工。如S.alvi和LactobacillusFirm-5細菌在20～25 d會趨于穩定，而Bifidobacterium屬和G.apicola則在25～30 d，細菌在第15天后開始下降，腸道細菌的減少可能是由于覓食的蜜蜂在15 d后第一次離開蜂巢時排便所致(Guoetal., 2015)。S.alvi、G.apicola和Bifidobacterium在15～20 d之間達到高峰，這與花蜜和蜜蜂蜂糧加工的年齡相對應。中華蜜蜂腸道微生物的數量在第15天或第20天之后開始下降，但在20 d之后，細菌有一個穩定的時期。

西方蜜蜂中核心微生物S.alvi、G.apicola和F.perrara是通過社會接觸定殖腸道的(Powelletal., 2014)。因此，在0日齡的工蜂中觀察到的無核心腸道菌群可以用工蜂的社會接觸最少來解釋。此外，Acinetobacter的相對豐度在0～1日齡時最高，說明Acinetobacter在工蜂腸道中起著重要作用；在0～1日齡這個階段，腸道菌群的結構發生了迅速的變化，尤其是核心菌屬，如Frischella、Snodgrassella和Gilliamella這3個核心屬主要占據Acinetobacter的生態位(Dongetal., 2020)。Lactobacillus和Bifidobacterium有助于蜜蜂對營養的吸收和保護，將從蜜蜂腸道分離出的Lactobacillus和Bifidobacterium噴灑到蜂巢、孵卵群和花粉上，顯著促進了可采蜂蜜的增加(Alberonietal., 2018)。這兩個核心菌屬LactobacillusFirm-5和Bifidobacterium的相對豐度在1～3日齡的期間顯著增加，在第4天后趨向穩定。L.kunkeei在工蜂的其他器官和蜂糧中都能發現，它在7～12日齡時期顯著增加，這個時期的工蜂主要工作是加工蜂蜜。蜜蜂個體在實驗條件下蜂巢外不接觸蜂蜜或哺育的工蜂，即使在8 d后也未能形成一個實質性的腸道群落，而蜜蜂暴露在自然蜂巢條件下，在4～6 d內，其穩定的群落由核心菌種主導(Powelletal., 2014)。蜜蜂幼蟲化蛹后，Firm系列的菌群和Gilliamella的數量都顯著下降(Hroncovaetal., 2015)。蜜蜂的9～30日齡期間，工蜂會離開蜂巢進行花粉、花蜜的采集，這個時候由于環境和飲食的變化，Bifidobacterium和F.perrara的豐度都顯著降低(Andersonetal., 2018; Dongetal., 2020)。Anderson等人(2018)認為Bifidobacterium是評估工蜂年齡的細菌指標，F.perrara是否能作為年齡評估指標需要進一步的研究。當工蜂年齡上升后，腸道微生物也開始老化，后腸的核心菌群LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5和B.asteroides逐漸耗盡(Andersonetal., 2018)。

蜜蜂腸道細菌的多樣性增加可能是由于幼蟲食物中花粉的增加。當花粉粒與稀釋的蜂蜜混合并進入后期幼蟲的腸道時，pH值從酸性到中性出現了大幅度的跳躍，這表明許多適應花蜜、蜂糧和蜂蜜的嗜酸菌可能在幼蟲腸道中短暫存在。即便如此，幼蟲微生物群與成年蜜蜂腸道微生物群并無顯著差異。雖然這些細菌可能在成年蜜蜂的營養處理中發揮作用，但在蜜蜂發育的早期和脆弱階段，它們可能有助于幼蟲免疫(Vojvodicetal., 2013)。

1.4 蜜蜂獲取腸道微生物的方式

蜜蜂是群居昆蟲，群居傳播對維持它們的微生物群落很重要(Martinsonetal., 2012; Kochetal., 2013)。社會行為，如食物的交哺可能讓昆蟲腸道群體的成員將微生物傳給它們的群體成員，從而建立一致的聯系。蜜蜂幼蟲個體在蜂巢外不接觸巢脾或哺育蜂，即使在第8天后也未能形成一個實質性的腸道群落，而蜜蜂暴露在自然蜂巢條件下，在4～6 d內，其穩定的群落由核心物種主導(Powelletal., 2014)。一些革蘭氏陽性的核心微生物群成員可以通過接觸蜂巢表面獲得，革蘭氏陰性種如S.alvi、G.apicola和F.perrara似乎是通過接觸哺育蜂或新鮮糞便獲得的，而不是通過進食獲得的(Powelletal., 2014)。G.apicola是蜜蜂核心后腸微生物群的一部分，被認為是蜜蜂腸道特有的(Kwongetal., 2014b; Kwong and Moran, 2015)。研究人員發現發現在許多花朵、花粉供應和蜜蜂腸道樣本中有一個細菌譜系，在16S rRNA基因序列中與蜜蜂G.apicola菌株99%相同(Martinsonetal., 2011; Moranetal., 2012)，表明G.apicola可能是由蜜蜂從花、花粉上的環境細菌進化而來。另一種原產于歐洲和北非的獨居蜜蜂Osmiabicornis，它們的幼蟲可能通過土壤獲得一些重要的腸道菌群，使它在沒有細菌或非常有限的細菌的情況下也能有效的消化食物，以促進其發育(Kelleretal., 2013)。

1.5 不同蜜蜂腸道微生物的比較

隨著人們開始關注蜜蜂的健康問題，東、西方蜜蜂腸道菌群鑒定及多樣性研究也受到重視。東、西方蜜蜂腸道核心菌群大致相同，但西方蜜蜂中含有Gamma-2(Gammaproteobacteria)、Alpha-1(Bartonella)和Alpha-2(Acetobacteraceae)在東方蜜蜂中沒有被檢測出來，熊蜂屬基本含有與西方蜜蜂相同的核心菌群，也無法檢測出Alpha-2(Jeyaprakashetal., 2003; Mohr and Tebbe, 2006; Babendreieretal., 2007; Cox-Fosteretal., 2007; Martinsonetal., 2011)。

其中Bartonella主要存在于東方蜜蜂后腸中，F.perrara則主要存在于西方蜜蜂的腸道，而擬桿菌門中的Apibacter在東方蜜蜂腸道中含量較高，西方蜜蜂含量較少(Kwong and Moran, 2016；胡沖等，2020)。有研究發現腸道菌多樣性差異最大的是在中蜂幼蟲和意大利蜜蜂蛹之間(張義強，2013)。同種蜜蜂位于不同地區腸道微生物可能有所不同。Khan等人(2017)對沙特阿拉伯兩個不同地理位置Al-Baha和Riyadh蜜蜂A.m.jemenitica腸道微生物比較，發現Riyadh比Al-Baha地區蜜蜂微生物群落的整體復雜性低(Khanetal., 2017)。腸道微生物群落的這種差異可能是由于腸道生理條件的差異，例如pH值、來自花蜜和花粉中的環境細菌、蜜蜂的年齡以及影響地理位置的季節或主要環境特征等。

2 影響蜜蜂腸道微生物菌群的因素

2.1 生物因素(病毒、細菌、瓦螨、微孢子蟲等)對腸道微生物的影響

蜜蜂病毒、細菌和寄生蟲等會嚴重破壞蜜蜂腸道微生物的平衡，是影響蜜蜂健康的重要因素(Erbanetal., 2015; Fantham and Porter, 2016; Krabergeretal., 2019)。而這些病毒和細菌能夠耐受與不同草食性、雜食性和食肉性昆蟲種類相關的胃、腸的生理環境(Lesteretal., 2015)。研究發現，感染歐洲軟腐病(European Foulbrood)和蜜蜂囊狀病(Sacbrood Virus)的幼蟲腸道菌群比未感染的幼蟲少，表明這些病原體與腸道細菌之間存在負相互作用(Guoetal., 2015)。共生菌S.alvi的含量與IAPV的感染率呈顯著負相關(劉姍等，2017)。

狄斯瓦螨Varroadestructor的出現常常伴隨著DWV，有研究發現兩種γ-蛋白細菌，即Frischellaperrara和Pasteurellaceaebacterium Trm1在感染DWV的工蜂中有顯著升高(Matsumotoetal., 2014)。而γ-蛋白細菌物種可能參與花粉壁的破壞(Engeletal., 2012)。而另外一種美洲幼蟲腐臭病(American foulbrood，AFB)，是最具傳染性和破壞性的蜜蜂疾病，病原是一種革蘭氏陽性桿狀芽孢桿菌，稱為Paenibacilluslarvae，只有齡期小于 30 h 的蜜蜂幼蟲才容易感染(Yueetal., 2008)。蜜蜂通過攝入含有P.larvae孢子的食物而感染，孢子在中腸腔中萌發，細菌在那里大量繁殖，最后攻擊并破壞中腸上皮細胞，侵入血腔，并將幼蟲分解成黏液團(Poppinga and Genersch, 2015)。

粘質沙雷氏菌Serratiamarcescens是一種常見的存在于成年蜜蜂的病原菌，在某些條件下，如正常腸道微生物群受到干擾或存在瓦螨，會讓蜜蜂感染該菌。由于蜜蜂經常暴露在可能破壞腸道微生物群的因素下，粘質沙雷氏菌感染可能是常見的，并可能導致菌落喪失；即使是少數細菌進入血腔也可能是致命的，這就支持了粘質鏈球菌的致病性被瓦螨加劇的可能性(Raymannetal., 2018a)。Good等人(2014)從蜜蜂腸道中分離出一些細菌并接種到花蜜中，結果發現蜜蜂并不喜歡Asaiaastilbes、Erwiniatasmaniensis和Lactobacilluskunkeei3種菌落的花蜜，而Metschnikowiareukaufii酵母則不影響蜜蜂的取食偏好。腸道微生物不僅可以作為共生菌影響蜜蜂的健康，還可能通過改變花蜜的化學成分和影響蜜蜂的覓食行為，影響蜜蜂作為傳粉者的功效(Goodetal., 2014)。

瓦螨目前被認為是西方蜜蜂最具毀滅性的病原，由瓦螨引起的疾病被稱為瓦螨病。瓦螨主要以蜜蜂的血淋巴為食，寄生在蜜蜂幼蟲和成蟲身上導致幼蟲死亡，如果沒有得到及時的防治，蜂群很快就會衰落死亡。(周婷等，2007)。瓦螨寄生的蜜蜂腸道細菌中Bartonella的相對豐度會增加，在瓦螨病存在下觀察到更豐富的細菌是S.alvi，這種細菌在后腸形成了生物膜的內層，而另一種細菌G.apicola形成了外層。G.apicola未受到瓦螨病的影響，由此推測，瓦螨寄生的蜜蜂體內的乳酸桿菌和Snodgrassella的相對豐度與生物膜厚度的增加有關，這是對瓦螨感染的反應(Hubertetal., 2017)。亮熱厲螨Tropilaelapsmercedesae是亞洲蜜蜂的一種寄生蟲，感染了T.mercedesae的蜜蜂乳酸桿菌豐富度明顯高于同期未感染蜜蜂(Maetal., 2019)。

微孢子蟲病是蜜蜂的主要病害之一，其病原包括蜜蜂微孢子蟲Nosemaapis和東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae。微孢子蟲只感染蜜蜂的中腸，會一定程度上改變腸道微生物群的總體組成(Rubanovetal., 2019)。N.ceranae感染導致飼糖蜜蜂腸道中Snodgrassella的豐度較高，Serratiamarcescens的豐度較低，此外，還會抑制與細胞更新有關的基因，導致營養不良，增加蜜蜂死亡率(Huang and Solter, 2013)。抗生素對腸道細菌的清除對蜜蜂免疫系統的功能產生了負面影響，增加蜜蜂感染微孢子蟲病的可能性(Lietal., 2017)。白堊病是由蜜蜂球囊菌Ascosphaeraapis(簡稱球囊菌)特異性侵染蜜蜂幼蟲而導致，這種菌能夠降解宿主體內的營養物質，最后導致宿主死亡。(郭睿等，2018)。

2.2 非生物因素(殺蟲劑、除草劑、花粉等)對腸道微生物群落的影響

除了上述生物因素對蜜蜂腸道微生物產生嚴重的影響，一些非生物因素如殺蟲劑、花粉、溫度、季節以及蜜蜂所處的地理位置等都有可能對蜜蜂的腸道豐度和多樣性造成影響(Goreetal., 2017; Riciglianoetal., 2017; Yangetal., 2019; Wangetal., 2020)。在測定3種農藥(毒死蜱、樂果和雙甲脒)對蜜蜂的毒性時，發現樂果是3種農藥中毒性最大的，并且對西方蜜蜂的毒性大于東方蜜蜂，而雙甲脒對中華蜜蜂和西方蜜蜂毒性最小(Yangetal., 2019)。接觸吡蟲啉也會導致蜂巢中蜜蜂的死亡率升高，并增加了受病原體感染的易感性，暴露于吡蟲啉的蜜蜂血淋巴細胞在體外的過氧化氫水平降低(Walderdorffetal., 2018)。盡管不同微生物種類之間存在潛在的調節相互作用，但腸道內過氧化氫水平的降低被認為是導致腸道微生物群發生變化的最可能原因(Walderdorffetal., 2018)。但是如今并沒有發現吡蟲啉影響蜜蜂腸道細菌群落的證據，甚至發現在吡蟲啉存在下，蜜蜂腸道細菌可以生長(Raymannetal., 2018b)。而一種殺蟲劑烯啶蟲胺，則會擾亂腸道微生物的平衡，降低蜜蜂的攝入量和生存率(Zhuetal., 2020)。氟胺氰菊酯是一種常見的有機殺螨劑，在西方蜜蜂的食物中添加少劑量的氟胺氰菊酯導致了蜜蜂腸道Proteobacteria類細菌滋生，高濃度的氟胺氰菊酯則引起子囊菌門的滋生(廖春華，2019)。農藥會直接或間接對蜜蜂等授粉昆蟲產生影響，而從蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)中提取的Cry1Ie蛋白則被認為是我國開發Bt玉米新品種防治玉米害蟲的候選蛋白，在實驗室條件下，發現Cry1Ie毒素對中國蜜蜂腸道菌群無影響(Jiaetal., 2017)。

除草劑和一些殺菌劑對蜜蜂的影響可能也不亞于殺蟲劑。在暴露于草甘膦的蜜蜂中，占優勢的腸道微生物種群的相對和絕對豐度降低，成年工蜂接觸草甘膦之后，增加了隨后接觸粘質沙雷氏菌的蜜蜂死亡率(Mottaetal., 2018)。蜜蜂幼蟲的免疫功能尚不健全，更容易受到病原體的侵害，高濃度的草甘膦影響了新生蜜蜂的腸道細菌群落，降低了幼蜂的存活率，由此可推測草甘膦會導致腸道微生物減少，降低蜜蜂的免疫能力(Daietal., 2018)。盡管低劑量殺菌劑對蜜蜂不致命，但高劑量的接觸對蜜蜂也是相當有害的，導致幼蟲死亡率增高，并改變其覓食行為(Zhuetal., 2014)。殺菌劑也會導致熊蜂腸道的大量菌落損失(Steffanetal., 2017)。

花粉也是影響蜜蜂腸道微生物的重要因素。如果蜜蜂需要消耗大量的花粉來獲得足夠的營養，便會需要更多的細菌定殖在直腸中消化花粉。花粉的營養質量，以及不同地點的花粉資源，也可能影響菌群組成 (Jonesetal., 2018)。從花粉中分離出來的酵母菌具有殺菌和發酵的特性，這兩種特性對幼蜂的發育都是至關重要的；這種生態關聯暗示了蜜蜂與其花粉微生物群之間高度的互利共生(Steffanetal., 2017)。花粉的消耗刺激了對蜜蜂有毒糖(木糖、阿拉伯糖、甘露糖)的水解，在腸道前端產生的糖分積聚在中腸，并持續存在于后腸，花粉消耗顯著影響消化道細菌總數和特異性豐度(Riciglianoetal., 2017)。除了花粉之外，糖分也是影響蜜蜂腸道的重要因素之一。蜜蜂對于蜂蜜的采食明顯高于對果葡糖漿及蔗糖的采食，這有可能是因為果葡糖漿對比蜂蜜缺乏必要的營養和氨基酸，降低了蜜蜂的采食率(丁琳，2016)。Wang等人(2020)測定了蜜蜂冬季取食蜂蜜、蔗糖和高果糖糖漿前后，中腸和后腸的細菌群落情況，發現季節、喂食的糖類型以及腸道空間的變化只會影響蜜蜂腸道優勢類群的豐度，但不會影響優勢類群的組成，優勢類群是相對保守的；喂食蔗糖后，中腸的微生物多樣性會高于喂食高果糖漿和蜂蜜組，而后腸的微生物低于高果糖漿和蜂蜜組。作為冬季食品的糖類對蜜蜂腸道優勢菌群的相對豐度有影響，而對類群的相對豐度沒有影響，從而影響蜜蜂越冬期間的健康和安全，蔗糖是非常適合蜜蜂越冬的食物(Wangetal., 2020)。也有研究認為蔗糖日糧增加了Rhizobiaceae、Acetobacteraceae、L.kunkeei這些亞優勢核心菌的相對豐度，降低了F.perrara的相對豐度，顯著改變了細菌組成(Tayloretal., 2019)。

腸道微生物多樣性在攝入抗生素后的幾天內就會減少,而且很少能完全恢復到初始細菌群落組成(Sekirovetal., 2008; Dethlefsen and Relman, 2011)。養蜂人最常用的兩種抗生素是四環素(或相關化合物土霉素)和泰樂菌素，而在蜜蜂腸道8種核心細菌中，4種細菌Bifidobacterium、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5和Snodgrassellaalvi受到四環素處理后豐度顯著下降，導致蜜蜂死亡率升高(Goreetal., 2017)。但是同時Gore等人(2017)也發現具有自然獲得腸道微生物群的蜜蜂，經四環素處理并在實驗室無菌條件下保存的蜜蜂表現出更高的死亡率，這在沒有微生物組(無菌蜜蜂)的處理蜜蜂中沒有觀察到，這意味著不是四環素影響蜜蜂的健康，而是蜜蜂腸道菌群失調。雖然對無菌蜜蜂沒有影響表明抗生素在使用的濃度下對蜜蜂沒有直接傷害，但很難將四環素對腸道微生物群的影響與對宿主的影響分開，有可能是四環素改變了宿主對病原體的易感性(Goreetal., 2017)。目前未發現長距離遷移會導致蜜蜂種群腸道微生物群落發生大的變化，在冬季天然的花卉食物對蜜蜂腸道微生物群的組成和功能只有細微的影響(Rothmanetal., 2018)。

3 蜜蜂腸道微生物的作用

3.1 蜜蜂腸道菌對蜜蜂健康的影響

蜜蜂一生中會遇到各種生物與非生物的壓力，腸道菌對于蜜蜂的健康起到非常重要的作用(Mattilaetal., 2012; Goodetal., 2014; Emeryetal., 2017)。蜜蜂以花粉為食，蜜蜂腸道微生物菌群能夠消化堅硬的花粉外壁，并消化吸收花粉中多種多糖、富含能量的物質，在培養的細菌基因組序列和亞基因組數據中獲得了多糖降解基因，揭示了Bifidobacterium和Gilliamella消化蜜蜂腸道中的多糖 (Zhengetal., 2019)。一些容易獲得的花粉營養物質(如氨基酸、糖和維生素)很可能被中腸的細菌吸收，而更難消化的化合物則由后腸中的微生物菌群來消化(Kesnerovaetal., 2017)。如今可確定3個主要活躍在腸道的細菌類(γProteobacteria、Bacilli和Actinobacteria)都參與分解復雜的大分子(如多糖和多肽)。微生物群落通過使用群落水平的生理特征來實現代謝這些富含碳的食物來源的能力(Leeetal., 2015)。總的來說，蜜蜂的腸道微生物區系中存在著具有獨特作用的細菌成員，這些細菌最終可以為宿主處理植物性食物做出貢獻。

蜜蜂腸道中含有的各種細菌可共同完成某項功能，或是各司其職。使用含有Lactobacillu和Bifidobacterium的糖漿制劑噴灑在空曠的養蜂場的蜂巢上，會導致蜜蜂腸道中Acetobacteraceae和Bifidobacteriumspp.的相對豐度有所增加，是由于它們參與了蜜蜂的營養和保護(Alberonietal., 2018)。而從蜜蜂中腸分離獲得的L.kunkei的混合物能降低感染Paenibacilluslarvae的死亡率，增加乳酸桿菌的數量，從而使幼蟲生存能力得到了提高(Arredondoetal., 2018)。同樣的，植物乳酸桿菌Lactobacilluplantarum也能減輕Nosemaspp.引起的蜜蜂腸道微生物群落的變化(Diazetal., 2019)。

Engel等人(2015a)發現蜜蜂腸道中的兩種γ蛋白桿菌之一的Frischellaperrara，是引起意蜂“結痂”表型的原因；這種表型的特征是在中腸-后腸交界處的幽門內形成一個深棕色到黑色的沉積物，形成一個局部的薄條帶，靠近馬氏管。該表型在成年工蜂出現后5～7 d形成。結痂蜜蜂的比例在不同的蜂群中有所不同(通常為40%～90%)，但與腸道中的F.perrara的豐度密切相關；同時用實驗室出現的蜜蜂進行實驗，表明用培植的F.perrara菌株定殖足以誘導結痂(Engeletal., 2015a)。關于蜜蜂飲食質量影響的研究表明，與后腸的其它腸道細菌相比，食用陳舊的花粉導致F.perrara的豐度顯著增加，這與宿主發育受損和死亡率增加有關(Maesetal., 2016)。但有趣的是F.perrara不僅誘導黑化反應，導致結痂表型，而且還激活宿主免疫系統的其他部分，包括信號感知和效應器功能(Emeryetal., 2017)。這種現象或許是免疫啟動，預先激活免疫系統可以增強對隨后病原體侵擾的保護，F.perrara與宿主的關系或許不能簡單的以有害或有益來概括，需要更進一步的研究。

3.2 腸道微生物對蜜蜂免疫的影響

腸道微生物群落可以通過調節免疫系統極大地影響蜜蜂的健康。然而，對于許多重要的昆蟲來說，腸道微生物菌群和其免疫功能之間的關系仍然知之甚少。抗菌肽(AMPs)是昆蟲抵御病原體入侵的天然免疫系統的重要組成部分。這些短肽在細菌、真菌和原生動物感染時釋放，通過穿膜和抑制蛋白折疊而破壞微生物細胞(Danihlíketal., 2016)。在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的免疫刺激下，蜜蜂血淋巴中誘導了4種AMPs產物Abaecin、Apidaecin、Defensin和Hymenoptaecin (Casteelsetal., 1990; Danihlíketal., 2016)。Kwong等人(2017)發現，在蜜蜂腸道微生物可以影響AMP-Apidaecin在血淋巴的濃度，導致Hymenoptaecin水平升高；不同的微生物菌群成員對蜜蜂免疫可能起不同的調節作用，表明腸道微生物群發揮的作用不僅限于腸道而是整個系統，包括血淋巴；此外，還證明Apidaecin存在于腸道腔內，這打開了蜜蜂免疫系統在構建腸道微生物群落中發揮作用的可能性。單靠S.alvi的定殖并不能增加Hymenoptaecin的表達，這表明S.alvi不能進行Hymenoptaecin的生產途徑(Kwongetal., 2017)。Al-Ghamdi等人(2018)探討了幼蟲食物中添加Paenibacilluslarvae孢子和腸道細菌是否能夠降低P.larvae感染西方蜜蜂幼蟲的致死效應，結果表明L.kunkeei和Bacilluslicheniformis均能降低蜜蜂幼蟲感染孢子后的死亡率，而其他細菌Fructobacillusfructosus和Bacillussubtilis在一定程度上降低幼蟲的死亡率(Al-Ghamdietal., 2018)。另外，Bifidobacterium群落在蜜蜂腸道中的活性越高，病原體的活性就越低；這種相關關系表明，Bifidobacterium可能通過調節蜜蜂的免疫反應或排除病原體，為蜜蜂提供健康益處(Evans and Lopez, 2004)。而另一種獨居蜜蜂Osmiabicornis除了蜜蜂典型的腸道微生物群外，還從其腸道中發現了G2II、C4和M1株的Bacillussubtilis，能抑制了Ascosphaeraspp.和Paenibacillus的生長(Sabateetal., 2009)，這些腸道微生物可能在蜜蜂免疫防御中發揮重要作用。

3.3 腸道微生物菌群對蜜蜂營養代謝的影響

由于蜜蜂不同腸道部位腸道菌的種類不一樣，因此不同的部位代謝物也不同。對蜜蜂血淋巴的單獨分析發現，其他昆蟲的腸道菌能產生對宿主有益的必需氨基酸，蜜蜂也同樣如此(Engel and Moran, 2013)。在蜜蜂對花蜜和花粉的代謝過程中，蜜蜂的腸道菌群起著重要的作用(Riciglianoetal., 2017; Maruscakovaetal., 2020)。蜜蜂腸道中相當大一部分微生物菌群進行食物碳水化合物的發酵。考慮到蜜蜂富含碳水化合物的飲食(由花蜜和花粉組成)，通過進化腸道微生物菌群以這類資源為生并不奇怪。G.apicola、F.perrara、LactobacillusFirm-4、LactobacillusFirm-5和蜜蜂相關的B.asteroides都能代謝葡萄糖和果糖，這兩種糖是蜜蜂食物中含量最豐富的糖(Engeletal., 2013; Ellegaardetal., 2015)。與熊蜂腸道微生物群落成員相比，意蜂中的B.asteroides物種群具有豐富多樣的基因，負責碳水化合物的利用 (Bottacinietal., 2012)。這些發酵細菌包括蜜蜂特有的乳桿菌屬和雙歧桿菌屬。蜜蜂腸道的雙歧桿菌和乳酸桿菌都有大量功能未知的細胞表面蛋白，可能參與植物成分的粘附或降解(Kwongetal., 2014a; Ellegaardetal., 2015)。蜜蜂腸道中另一種主要的發酵微生物是G.apicola，G.apicola菌株的基因組分析已經確定了一大類基因，這些基因負責糖類的吸收和發酵，但存在不完全的三羧酸(TCA)循環和退化的需氧呼吸鏈(Kwongetal., 2014b)。蜜蜂腸道中存在不同的代謝生態位，這在一定程度上可以解釋為細菌沿著腸道各個部位的不同分布 (Kesnerovaetal., 2017)。腸道微生物菌群誘導了與營養和代謝相關的宿主表型，腸道微生物群改變了不同腸腔的理化性質和代謝譜，而糖酵解是蜜蜂腸道的主要代謝活動(Zhengetal., 2017)。發酵的最終產物因種類而異，但通常包括乳酸和醋酸(Kwong and Moran, 2016)。在大多數情況下，幾種腸道菌會代謝同一化合物，表明蜜蜂腸道細菌具有重疊的代謝能力(Bonilla-Rosso and Engel, 2018)。

4 蜜蜂腸道微生物的研究方法

4.1 蜜蜂腸道微生物的分離和培養方法

蜜蜂腸道微生物群落分離和鑒定首先需要確定樣本是整個腸道或部分腸道。對于蜜蜂腸道的解剖，使用1%氯水溶液(二氯異氰尿酸鈉或過氯酸鈉)擦拭蜜蜂全身，清除可能會影響實驗結果的其他微生物及核酸分子。每頭蜜蜂浸泡上述溶液2～7 min后，用無菌純凈水沖洗3次。為了避免影響后續PCR的反應，導致結果出現誤差，因此需要確保無菌水沖洗了所有含氯試劑(Engeletal., 2015b)。提取DNA之前對昆蟲進行表面消毒是一種常見的做法，但也有人質疑這一耗時的步驟是否對微生物群落分析有任何影響，因此分別用5種不同的方法，即冷凍、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、溴化十六溴銨(CTAB)和無防腐劑室溫進行處理，將4種昆蟲的復制個體完整保存兩個月，然后對整個標本進行16S rRNA基因測序，與未消毒的昆蟲相比，表面消毒并沒有改變細菌群落結構，這可能是由于昆蟲體內的微生物生物量相對于其表面要大得多(Hammeretal., 2015)。在對成百上千的昆蟲標本進行大規模的分子研究時，表面消毒可能不值得花費時間和精力，這些信息將有助于研究人員設計不同的方案和策略進行實驗。解剖腸道組織后，加入適量無菌Krebs-Ringer 溶液，在漩渦振蕩器上用滅菌的研磨棒充分研磨腸道，然后將研磨液用無菌厭氧的生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取10-1、10-3、10-53個梯度的稀釋液(100～150 μL)涂布于不同培養基的培養皿上(也可放入液體培養基中)。將涂布后的平板分別放至35～37℃厭氧培養箱(含氧量≤1%)中培養48～72 h。每個培養基和梯度設3次重復，對表征不同的菌落進行厭氧挑菌(董志祥等，2018)。

4.2 蜜蜂腸道微生物的保存方法

目前蜜蜂腸道菌的培養方法是通過無菌操作從蜜蜂腸道中提取共生菌，接入適合該菌生長的培養基(如胰酪胨大豆瓊脂培養基、心浸液瓊脂培養基、腦心浸液瓊脂以及西紅柿汁瓊脂培養基(Oxoid、Basingstoke、Hampshire、UK)，乳酸細菌培養基(MRS)，液體培養基(Lactobacillus Carrying Media)等)，接著將培養皿放到35～37℃的恒溫培養箱中；但大部分蜜蜂腸道菌都需要一個低氧或者無氧的環境才能生長，因此一個專門的密封設備、CO2培養箱和N2的培養箱等裝置是有利于腸道菌的培養(Engeletal., 2015b)。

4.3 蜜蜂腸道微生物的分子鑒定方法

隨著現代分子生物學技術的發展，一些以16S rRNA基因序列分析為基礎的分子技術被廣泛用于微生物的鑒定、分類以及微生物之間進化關系的確定等，如DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)、TRFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)等常規分子生物學技術(Shietal., 2010)，以及可精確定位細菌在昆蟲腸道中分布的位置熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)方法(Engel and Moran, 2013)，這些技術主要用來鑒定或描述一些特殊菌群的特征。變性梯度凝膠電泳(DGGE)是根據DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。DGGE對微生態的分析一般包括3個步驟：核酸提取、16S rRNA序列的PCR擴增以及DGGE指紋圖譜分析。通過克隆、測序建立微生物區系的16S rRNA/DNA文庫，通過系統發育分析，建立進化樹，從而獲得微生物多樣性信息。末端限制性片段長度多態性(TRFLP)分析是一種分析生物群落的指紋技術，它的基礎原理涉及末端熒光標記的PCR產物的限制性酶切，優點是可以檢測微生物群落中較少的種群。熒光原位雜交技術是一種重要的非放射性原位雜交技術，原理是利用報告分子(如生物素、地高辛等)標記核酸探針，然后將探針與染色體或DNA纖維切片上的靶DNA雜交，若兩者同源互補，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。此時可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對DNA進行定性、定量或相對定位分析。微生物組數據的獲得通常有3種方式，即16Sr RNA基因序列測定、宏基因組測定(描述細菌的潛在功能)、宏轉錄組數據(描述活性基因的表達)(Goodrichetal., 2014)。

4.4 無菌蜜蜂的構建方法

無菌蜜蜂一般使用兩種方式構建，即從蜜蜂卵或者從晚期蛹開始培養。從健康的蜂巢中收集到蜜蜂卵經過消毒后，挑到無菌的96孔板中放置在34℃、相對濕度為80%培養箱內避光培養。前3 d使用無菌的蜂王漿喂養，然后用無菌的蜂糧替代蜂王漿。每24 h將幼蟲轉移至新的含有飼料的孔板內培養，即將化蛹時，將幼蟲移至墊有兩層濾紙的24孔板內準備化蛹和羽化。

另一種構建方式根據Zheng等人(2017)的方法，從蜂箱的孵卵架中手動取出晚期蛹(即有深色眼睛和角質層的蛹)，并放入無菌塑料箱中。如果蜜蜂自己啃出蜂巢，可能會被巢脾表面殘留的腸道共生菌接種。讓蛹在35℃的生長室中羽化。新羽化的個體被保存在一個帶有可移動底座和通風孔的無菌杯狀貯藏籠中，并用滅菌的蔗糖糖漿(0.5 M)和蜂糧喂養。蜂糧提前用γ射線(30 kgy)滅菌。滅菌的糖漿鋪在LB板上并在37℃下過夜孵育來驗證滅菌是否完全(Zhengetal., 2017)。

5 蜜蜂腸道微生物的應用

蜜蜂一生中會受到許多病毒、寄生蟲等的病原體感染，為了阻止這些病原體的傳播，科學家們試圖基因改造與昆蟲相關的共生微生物(Durvasulaetal., 1997)。轉基因項目分3個階段展開：首先，必須識別并描述來自腸道的細菌，它們具有作為轉基因載體的巨大潛力；其次，以報告蛋白轉化細菌，測試并描述其性能，包括蜜蜂的有效返回、在腸道中的停留時間、不干擾腸道內已建立的微生物區系、未影響蜜蜂存活；最后，所選擇的細菌被轉化為對抗蜜蜂病原體的效應基因(Rangbergetal., 2012)。

Leonard等人(2020)選定腸道共生菌S.alvi，用以誘導進行RNAi免疫應答，經過工程化的S.alvi可以觸發瓦螨RNAi反應來殺死寄生的瓦螨，提高了蜜蜂的存活率，保護了蜜蜂的健康(Leonardetal., 2020)。副轉基因(Paratransgenesis)是一種基于基因改造的共生微生物，使其表達傳遞效應蛋白，阻止病原體的發展或傳播的方法(Durvasulaetal., 1997)。環境中廣泛分布的L.kunkei也符合成為合適的副轉基因候選株所需的3個標準；它是可轉化的，其轉化的衍生物不會對蜜蜂的健康產生負面影響，并且轉化的細菌能夠在蜜蜂腸道中存活至少一段時間(Rangbergetal., 2015)。

眾所周知，乳酸菌可以抑制其他微生物的生長，無論它們是與宿主共同進化還是通過選擇伴侶的機制被宿主從環境中吸收，乳酸菌都是有益的(McFredericketal., 2013)。Daisley等人(2020)發現，以營養小餡餅于蜂箱中添加益生菌乳酸桿菌可抑制自然發生的美洲幼蟲腐臭病。利用實驗室飼養的蜜蜂幼蟲進行的體外實驗表明，LactobacillusplantarumLp39、LactobacillusrhamnosusGR-1和LactobacilluskunkeeiBR-1(包含在生物制劑中)可以上調關鍵免疫基因的表達，降低病原菌載量，提高幼蟲被感染后的存活率(Daisleyetal., 2020)。這些發現表明，使用含有乳酸桿菌的蜂箱補充劑可減少致病菌引起的蜂群損失，對養蜂人來說是實用和負擔得起的。

從健康蜜蜂的消化道中分離出的LactobacillusbrevisB50以花粉懸浮液的形式應用于蜂群，發現蜜蜂乳酸菌與腸道菌的比例顯著增加，證實了被測試的益生菌制劑可增強蜂群的免疫力，從而增強它們對傳染病和應激條件的抵抗力(Maruscakovaetal., 2020)。而LactobacillussalivariusA3iob從蜜蜂腸道中分離出來(Audisio and Benitez-Ahrendts, 2011)，最近被證明是一種天然的替代品，它能提供更高的蜂蜜產量，從而對養蜂人的經濟產生積極的影響 (Fanciottietal., 2018)。蜜蜂腸道中解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，這兩種菌都可用于納豆的發酵生產(徐艷等，2017)。益生菌制劑不僅是對蜜蜂有益的，還有研究發現從蜜蜂產品中分離出的L.kunkeiYB38可能促進人類產生IgA，提高人體的免疫力(Asamaetal., 2015)。隨著生物技術的進步，關于蜜蜂腸道微生物的應用一定會越來越完善，對人類生產、健康方面都帶來積極的影響。

6 問題與展望

隨著人們對蜜蜂健康的關注，近年蜜蜂腸道微生物的研究與應用取得了長足的進展。這一領域之所以成為蜜蜂研究的熱點，主要仍存在許多問題有待突破。

蜜蜂腸道具有一個僅由5個菌種組成的簡單核心菌群。但是，蜜蜂的腸道結構、免疫系統、生活環境、食物組成是如何通過長期進化選擇核心菌群的？可否通過外源菌株改造蜜蜂腸道菌群，從而培育優勢蜂群？蜜蜂腸道中未被培養的細菌約占蜜蜂腸道細菌種類總數的32.42%(郭軍，2015)，這些目前人工尚未培養的菌群在蜜蜂腸道內的功能研究仍是未來之選。蜜蜂的健康狀態和腸道微生物之間存在著平衡關系，腸道微生物群落失衡時將導致病原體的入侵，因此有必要深入了解這些細菌在健康群、疾病群和受脅迫群中的結構和功能，以及它們與蜜蜂發生作用(如營養和免疫等)的分子機制。蜜蜂腸道微生物的分子操作是極具吸引力的方向，可用于構建抵抗病原、提高免疫力、改善營養結構以及提高蜂產品產量的蜜蜂群體(Casaloneetal., 2020)。