基于RNA-Seq技術的MDCK細胞成瘤性關鍵基因的驗證

賀 丹，楊 迪，王家敏，柏家林*

（1.西北民族大學生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030 2.西北民族大學實驗教學部，甘肅 蘭州 730030 3.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

MDCK細胞（Madin-Daby Canine Kidney Cells,MDCK）由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬腎臟組織分離培育建立[1]，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，是公認的適于流感病毒復制的3種細胞系之一。目前，MDCK細胞被用于分離流感病毒，分離菌株的抗原性和基因特征相對穩定，更接近原始標本[2]。流感(Influenza)，是由甲(A) 、乙(B) 、丙(C) 三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病，常造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴發流行及散發。其中，甲型流感病毒由于其抗原性而易于突變，具有高度傳染性，容易導致人畜死亡[3-4]。目前，國際上已有企業已批準利用MDCK細胞生產流感疫苗。

2005年11月16日疫苗和相關生物制品顧問委員會（VRBPAC）組織召開的會議討論了MDCK細胞作為細胞基質用于流感疫苗生產的相關事宜，并且著重討論了MDCK細胞的成瘤性問題。會議期間諾華公司、荷蘭蘇威制藥公司、美國醫學免疫學公司分別做了MDCK細胞的研究報告[5]。諾華公司的研究報告顯示無血清懸浮培養型MDCK細胞的成瘤性非常強，10個細胞就可以對裸鼠成瘤，但是對該公司通過馴化獲得的MDCK細胞株33016-PF的研究顯示該細胞株對裸鼠不成瘤。荷蘭蘇威制藥公司的研究報告顯示MDCK細胞（CCL-34）母細胞（P56）接種的細胞量高于107細胞對裸鼠成瘤，建立的細胞庫細胞傳代至P98代時接種105細胞量就對裸鼠形成腫瘤。美國醫學免疫學公司生產流感疫苗使用的細胞是該公司自主研發獲得的無成瘤性MDCK貼壁細胞株，接種107細胞量對裸鼠不成瘤。

目前，獲得無成瘤性MDCK細胞株仍是各國科研人員研究的重點。本研究使用單克隆技術建立了弱成瘤MDCK-CL35、較弱成瘤MDCK-CL09細胞株。運用RNA-Seq技術獲得高成瘤性和單克隆細胞株低成瘤性MDCK細胞差異表達的基因（DEGs），發現了降低單克隆細胞致腫瘤性的潛在分子機制，為建立MDCK低成瘤的細胞系奠定基礎。本研究通過對三株細胞（高成瘤MDCK-W73、弱成瘤MDCK-C35、較弱成瘤MDCK-C09）轉錄組測序結果分析可知，FLT4、GALNT12、SQSTM1、FOXN2、TNFAIP8、ELP1、STOM、RBMS2、RBMS2、SHB、GCAT、AFF4和GOPC可能是導致MDCK成瘤性的關鍵基因，對差異基因進行驗證。

1 材料和方法

1.1 總RNA抽提

收取MDCK-W73、MDCK-CL35以及MDCKCL09細胞（6孔板80%細胞密度），放在新的無RNase 的1.5 ml離心管中，加入500μl Trizol，置于冰上5 min，使細胞充分裂解。4℃ 12 000 g，離心5 min，去除沉淀；每管加入200μl氯仿，振蕩混勻，冰上靜置15min。4℃12 000 g，離心15min，小心吸取200 μl上清，加入到新的預冷的無RNase的1.5 ml離心管中。在新的1.5ml離心管中加入等體積預冷的異丙醇，振蕩混勻后冰上放置10 min；4℃ 12 000 g，離心10 min，棄上清，保留沉淀。加入500 μl 75 %乙醇（用DEPC水新鮮配制），將沉淀輕輕重懸；4℃ 8 000g，離心5 min，去除大部分上清液，保留沉淀；室溫放置5 min，使殘留液體揮發。待RNA沉淀基本透明時，加入無DNase/RNase ddH2O（加入體積視RNA沉淀量而定）至完全溶解，-80℃保存備用[6]。使用NanoDrop2000分析測定所抽提RNA濃度純度，使用瓊脂糖凝膠電泳測定抽提RNA的完整性。

1.2 反轉錄獲得cDNA

根據promega reverse transcription system 操作說明，反應溫度及程序設置：70℃反應5 min，冰上放置5 min。

如表1混合上述物質，按表2反應體系（冰上進行），混勻，短暫離心；反應溫度及程序設置：25℃反應5 min，42℃水浴反應1 h，70℃水浴15 min（使RT酶失活），將得到的RT產物 -cDNA置于-20℃保存。

1.3 實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測成瘤相關基因表達

收取細胞，提取RNA，反轉錄后，使用實時熒光PCR儀進行檢測。按照All-in-one SYBR Green 實時熒光定量PCR試劑盒操作說明書對表3中的反應體系進行配置，利用內參基因β-actin進行不同基因（引物序列見表4）相對表達量的分析。反應程序為：95℃預變性30 s，94℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸15 s，共四十個循環。

表1 試劑及反應體系

表2 試劑及反應體系

1.4 數據分析

使用相對定量分析F=2-ΔΔCt進行數據分析。

ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值；

-ΔΔCt=NC組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值；

2-ΔΔCt反映各樣品相對NC組樣品目的基因的相對表達水平。

表3 反應體系

2 結果

2.1 總RNA提取與質檢結果

使用NanoDrop2000分析測定所抽提RNA濃度純度，使用瓊脂糖凝膠電泳測定抽提RNA的完整性。如表5所示，所有樣本的OD260/280均分布于2.01～2.08之間，OD260/230均分布于2.05-2.13之間。OD260/280比值分布于1.8～2.1之間，OD260/230≥1.5提示提取的RNA純度高。

對各組樣本的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳（圖1），結果顯示有18 s和28 s兩條條帶，RNA條帶清晰，無色素、蛋白、糖類等雜質污染。結果表示試驗中提取的RNA純度高，沒有發生降解；無蛋白質、DNA等其他殘留，樣品質量合格可以運用到后續的實驗。

表4 引物序列信息

表5 RNA純度檢測結果

圖1 瓊脂糖凝膠電泳測定抽提RNA的完整性

2.2 qRT-PCR檢測基因表達

在 MDCK-W73、MDCK=C09和MDCK-C35中，各基因的相對表達量如圖2所示。試驗結果顯示，GALNT12、SQSTM1、ELP1、TNFAIP8和STOM 在各組細胞中均極顯著表達（P≤0.01）。FLT4、FOXN2、GCAT、AFF4、SHB、GOPC 和RBMS2在各組細胞中均顯著表達（P≤0.05）。

圖2 MDCK細胞成瘤性相關基因的RT-PCR結果

2.3 qRT-PCR與高通量測序（RNA-Seq）的數據對比

將qRT-PCR的結果與細胞高通量測序（RNA-Seq）的結果進行對比，結果如表6所示。除了RBMS2在MDCK-C09細胞中未檢測到基因表達，GCAT、GOPC在MDCK-C35細胞亦未檢測到基因表達，其余基因在各組細胞中均有表達，RT-qPCR與RNA-Seq結果相一致。將各個基因的相對表達量和FPKM制作成折線圖可以發現（圖3），各基因在不同成瘤性細胞中的表達具有差異性，且qRT-PCR與RNA-Seq的差異性表達相一致。由此說明，RNA-Seq測序結果真實可靠，為后續的試驗奠定了良好的基礎。

圖3 各基因qRT-PCR的相對表達量和RNA-seq測序（FPKM）數據對比

3 討論

高通量測序技術（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志[7-8]。目前，高通量測序開始廣泛應用于尋找疾病的候選基因上。在本研究的前期試驗中，選擇低成瘤細胞系MDCK-C09、MDCK-C35與高成瘤細胞系MDCK-W73進行高通量測序（RNA-Seq），以期篩選出與MDCK細胞成瘤性相關的關鍵基因進行后續研究。在高通量測序中，mRNA的表達量結果以FPKM為單位，FPKM 能消除基因長度和測序差異對計算基因表達量的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣本間的基因表達差異。為了驗證FLT4、GALNT12、SQSTM1、FOXN2、TNFAIP8、ELP1、STOM、RBMS2、RBMS2、SHB、GCAT、AFF4和 GOPC這12個關鍵基因是否如RNA-Seq測序中存在顯著性差異，對12個基因進行了qRT-PCR測定。

實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應（Realtime RT-PCR，qRT-PCR）就是結合了熒光定量技術的反轉錄PCR：先從 RNA 反轉錄得到cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR進行定量分析（qPCR）的以微量DNA進行目的片段擴增的方法[9-10]。通過DNA鏈的熱變性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三個步驟循環往復，可在短時間內擴增DNA達100萬倍以上。本研究使用染料法進行qPCR檢測。SYBR Green是一種非對稱花菁染料，能夠結合于所有雙鏈DNA雙螺旋小溝區域[11]。在游離狀態下，SYBR Green只發出微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強。因此，當將SYBR染料添加到PCR反應體系中，SYBR能結合到模板和擴增產物中發出熒光，隨著每輪擴增，產物量呈指數型上升，熒光也隨之上升并被儀器檢測到[12]。在qPCR的反應程序設定中，通常情況下，即使模板是環狀質粒或基因組DNA，預變性時使用95℃ 30 s即可，也可以依據模板情況適當延長變性時間到1～2 min。因變性時間過長可能會降低酶活性，所以不能超過2 min。如果Real Time PCR目的片段長度低于300 bp，則95℃變性3～5 s即可。對于退火溫度，應先嘗試常規程序。如需優化溫度，在56～64℃范圍內調整。如果反應效果不好，可以適當延長反應時間。

表6 MDCK細胞成瘤性相關基因的RT-PCR的相對表達量和測序數據（FPKM）

qRT-PCR 定量分析結果的可靠性與內參指標密切相關，為了篩選出在所有樣本均能穩定表達的內參指標，本研究運用能綜合分析的Ref Finder工具進行篩選，結果表明β-actin在所有樣本中綜合穩定度最高，其表達水平也與各因素無關，是理想的內參指標[13]。在整個PCR體系中，引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的DNA結合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進行有效的延伸。