冬凌草甲素對甲狀腺癌細胞放射敏感性的影響及機制

黃清波

(淄博市第一醫院藥學部，山東 淄博 255200)

甲狀腺癌屬于內分泌系統惡性腫瘤，其發生可能與電離輻射、雌激素、遺傳、碘的不合理攝入等多種因素有關，總體發病率呈上升趨勢〔1〕。1974～2013年，美國甲狀腺癌發病率和死亡率平均每年分別增加3.6%和1.1%，根據人口統計等數據預測，到2030年甲狀腺癌將成為美國第4大惡性腫瘤〔2，3〕。在甲狀腺癌的治療中，綜合手術、放療、化療等多模式治療提高了患者生存率，而放射敏感性的降低是限制放療效果的主要因素〔4〕。冬凌草具有活血止痛、抗菌消炎、清熱解毒等功效，可用于治療癌癥〔5〕。冬凌草甲素(Ori)是冬凌草抗腫瘤的主要活性成分，可從香茶菜、毛葉香茶菜等多種植物中提取，具有調節細胞周期，誘導細胞自噬、凋亡等功能〔6，7〕。研究表明〔8～10〕，Ori可有效抑制人結腸癌、胃癌等多種腫瘤細胞增殖并調節細胞耐藥性，但其對癌細胞放射敏感性的研究較少。本文擬探討Ori對BCPAP細胞放射敏感性的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清(批號：SH41288)、RPMI1640培養液(批號：SH30807)購自美國Gibco-BRL公司；噻唑藍(MTT，批號：M2129)、碘化丙啶(PI，批號：D4543)購自美國Sigma公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒(批號：170207)購自美國Coulter公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(批號：PC0020)、吉姆薩染色液(批號：G1015)、二甲基亞砜(DMSO，批號：D8370)購自北京Solarbio公司；硝酸纖維素膜(批號：HATF00010)購自Millipore公司；caspase-3(批號：20220)、caspase-9活性檢測試劑盒(批號：20009)購自美國R&D 公司；一抗購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自武漢博海生物公司；MCO-18AC型CO2培養箱購自日本SANYO公司；流式細胞儀購自美國BD公司；HBS-1096B型酶標儀購自南京德鐵實驗設備公司。

1.2細胞培養及照射 使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液于37℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱培養Nthy-ori 3-1和BCPAP細胞。待細胞生長至對數期，胰酶消化收集，以5×103個/孔接種至96孔板，以Varian IX直線加速器6 MV X射線照射，劑量率3 Gy/min，源皮距100 cm。

1.3克隆形成實驗檢測細胞存活分數 取生長對數期的Nthy-ori 3-1和BCPAP細胞，消化離心收集，以適宜濃度接種于6孔板，分為Ori組和照射組。Ori組給予不同濃度(2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L)的Ori作用24 h，以等量DMSO處理為對照組；照射組細胞給予2.5、5.0、10.0 μmol/L Ori作用24 h后，以0、2、4、6、8 Gy X射線照射，繼續培養14 d。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后4 % 多聚甲醛固定，吉姆薩液染色30 min，洗去染液，晾干后進行克隆計數。每組3個復孔，實驗重復5次，計算細胞存活分數。

1.4MTT法檢測細胞活力 取Nthy-ori 3-1和BCPAP細胞以5×103個/孔接種于96孔板，以含終濃度2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L Ori的RPMI1640培養液常規培養24 h，DMSO組為對照；收集BCPAP細胞接種至96孔板，分為DMSO(對照)組、Ori 5 μmol/L組(5 μmol/L Ori干預)、IR組(4 Gy X射線照射)、Ori 5 μmol/L+IR組(5 μmol/L Ori干預聯合4 Gy X射線照射)、Ori 5 μmol/L+IR+丙二醇甲醚酯酸酯(PMA)組〔5 μmol/L Ori和100 μmol/L PMA干預聯合4 Gy X射線照射〕。以上各組細胞培養24 h，加入20 μl MTT(5 mg/ml)，孵育4 h后吸除培養液，加入150 μl DMSO振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(A)值，實驗重復5次。

1.5流式細胞術檢測細胞周期 收集DMSO組、Ori 5 μmol/L組、IR組、Ori 5 μmol/L+IR組細胞，消化離心，PBS重懸細胞。以75%預冷無水乙醇4℃固定過夜，離心去上清，加入5 μl PI，室溫染色30 min，流式細胞儀檢測各組細胞周期。

1.6細胞凋亡檢測 收集DMSO組、Ori 5 μmol/L組、IR組、Ori 5 μmol/L+IR組細胞，PBS洗滌3次；按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書分別加入195 μl Annexin V-FITC結合液和5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻，10 μl PI室溫避光孵育20 min，立即使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7Western印跡法檢測P53、P21、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)1、B淋巴細胞瘤(Bcl)2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、caspase-9、細胞外信號調節激酶(ERK)、磷酸化(p)-ERK蛋白表達 使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細胞，4℃，3 000 r/min離心20 min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白樣品濃度。取40 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后電轉至硝酸纖維素膜上，含5%脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h；分別加入相應的一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜后加入HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗滌，使用電化學發光(ECL)試劑盒顯示條帶，以β-actin為內參，實驗重復3次。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1Ori抑制Nthy-ori 3-1和BCPAP細胞活力 克隆形成實驗結果顯示，Ori能降低Nthy-ori 3-1和BCPAP細胞存活分數，抑制細胞增殖，呈濃度依賴性，對比Nthy-ori 3-1細胞，Ori對BCPAP細胞活力的抑制作用更明顯(P<0.05)，見表1。MTT法檢測不同濃度Ori干預后細胞活力，發現2.5、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L Ori能明顯抑制BCPAP細胞活力(P<0.05)，見表2。10.0、20.0、50.0 μmol/L Ori處理36 h、48 h顯著抑制Nthy-ori 3-1細胞活力(P<0.05)，見表3。

表1 不同濃度Ori抑制Nthy-ori 3-1組 和BCPAP組細胞存活率比較

與對照組比較：1)P<0.05；與Nthy-ori 3-1組比較：2)P<0.05

表2 不同濃度Ori對BCPAP細胞吸光度值的影響

與對照組比較：1)P<0.05；表3、7、8、11同

2.2Ori對BCPAP細胞的放射增敏作用 不同劑量X射線照射后對比對照組，Ori 2.5、5.0和10.0 μmol/L組BCPAP細胞存活分數明顯減小(P<0.05)；X射線照射劑量為2、4、6、8 Gy時，Ori 2.5、5.0和10.0 μmol/L組細胞存活分數較0 Gy顯著減小(P<0.05)，見表4。不同濃度Ori處理的Nthy-ori 3-1細胞存活分數各照射劑量無明顯變化(P>0.05)，見表5。Ori 5.0 μmol/L+IR組BCPAP細胞活力明顯低于Ori 5.0 μmol/L組和IR組(P<0.05)，而IR組細胞活力低于Ori 5.0 μmol/L組(P<0.05)，表明5.0 μmol/L Ori對BCPAP細胞具有放射增敏作用，見表6。

表3 不同濃度Ori處理不同時間點對Nthy-ori -3-1細胞吸光度值的影響

表4 不同照射劑量對BCPAP細胞存活率比較

與對照組比較：1)P<0.05；與0 Gy比較：2)P<0.05

表5 不同照射劑量對Nthy-ori 3-1 細胞存活率影響

表6 處理不同時間點Ori抑制各組BCPAP細胞存活率比較

與Ori 5.0 μmol/L組比較:1)P<0.05；與IR組比較:2)P<0.05

2.3Ori聯合X射線照射對BCPAP細胞周期的影響 與對照組相比，Ori 5.0 μmol/L組細胞周期無明顯變化(P>0.05)，IR組和Ori 5.0 μmol/L+IR組細胞S期、G0/G1期比例明顯下降(P<0.05)；Ori 5.0 μmol/L+IR組細胞S期、G0/G1期比例下降幅度最大，見表7。

2.4Ori對BCPAP細胞p53、p21、CDKI蛋白表達的影響 對比對照組，Ori 5.0 μmol/L組、IR組、Ori 5.0 μmol/L+IR組細胞p53、p21蛋白表達顯著上調(P<0.05)，CDK1蛋白表達顯著下調(P<0.05)，Ori 5.0 μmol/L+IR組細胞p53、p21、CDK1蛋白表達上調或下調幅度最大。見圖1、表8。

表7 Ori 聯合 X 射線照射對 BCPAP 細胞周期值的影響

圖1 各組細胞p53、p21、CDK1蛋白表達

2.5Ori增加輻射照射對BCPAP細胞凋亡的誘導作用 對比對照組，Ori 5.0 μmol/L組、IR組、Ori 5.0 μmol/L+IR組BCPAP細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，Ori 5.0 μmol/L+IR組細胞凋亡率顯著高于IR組和Ori 5.0 μmol/L組(P<0.05)，見圖2、表9。進一步檢測凋亡相關蛋白表達發現，與對照組相比，Ori 5.0 μmol/L組、IR組、Ori 5.0 μmol/L+IR組細胞Bcl-2蛋白表達顯著下調(P<0.05)，Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達顯著上調(P<0.05);與IR組和Ori 5.0 μmol/L組比較，Ori 5.0 μmol/L+IR組Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表達改變最明顯(P<0.05)，見圖3、表10。

表8 Ori 對BCPAP細胞p53、p21、CDKI蛋白表達的影響

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

表9 不同照射時間點各組BCPAP細胞凋亡率比較

與對照組比較：1)P<0.05；與Ori 5.0 μmol/L、IR組比較：2)P<0.05；表10同

2.6Ori調控ERK-p53通路對BCPAP細胞的放射增敏作用 Ori 5.0 μmol/L+IR組BCPAP細胞活力較對照組明顯下降(P<0.05)，p-ERK蛋白表達顯著下調(P<0.05)；Ori 5.0 μmol/L+IR+PMA組細胞活力顯著回升(P<0.05)，p-ERK蛋白表達顯著回升(P<0.05)；各組細胞中ERK蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，見圖4、表11。

表10 各組BCPAP凋亡細胞蛋白表達比較

圖4 各組細胞中ERK、p-ERK蛋白表達

表11 各組BCPAP細胞中ERK、P-ERK蛋白表達及細胞活力對比

3 討 論

Ori是從植物中提取出的二萜類化合物，能夠抑制細胞周期蛋白D1表達，阻滯細胞周期；通過調節細胞內磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸激酶(Akt)信號通路和ERK通路誘導細胞自噬、凋亡；從而對腫瘤發揮抑制作用〔6，11〕。其抗腫瘤活性引起癌癥生物學家的廣泛關注，Li等〔12〕研究發現，Ori能夠調節自噬相關蛋白beclin-1、LC3-Ⅱ和凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2表達，誘導人乳腺癌細胞凋亡。在非小細胞肺癌細胞中，Ori可抑制表皮生長因子受體(EGFR)/ERK/基質金屬蛋白酶(MMP)-12和蛋白磷酸酶(PP)2A的癌性抑制因子(CIP2A)/PP2A/Akt信號通路，增強非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性；并且對食管癌細胞具有明顯的放射增敏作用〔13，14〕。在甲狀腺癌的研究中，10 μmol/L Ori干預可促進BCPAP細胞中DNA修復酶(PARP)及p-ERK蛋白表達，抑制細胞增殖并誘導凋亡〔15〕。細胞周期調控與細胞凋亡是研究癌癥發生發展機制的重要內容，其中，p53介導的細胞信號轉導途徑起重要作用。p53是一種人體腫瘤抑制基因，可與其下游細胞周期素依賴性激酶抑制因子p21共同組成細胞周期檢查站，DNA損傷則細胞周期停滯〔16，17〕。CDK1是周期蛋白依賴性激酶家族的一員，p53激活p21基因轉錄后，p21與CDK1結合成復合物或干擾細胞周期蛋白依賴性激酶(CAK)磷酸化，抑制CDK1活性，抑制周期蛋白表達，使細胞停滯在G2期〔18，19〕。bcl-2基因家族與細胞凋亡的調節密切相關，其中Bcl-2和Bax分別在抑制凋亡和促進凋亡起關鍵作用，Bcl-2/Bax比值直接決定細胞是否發生凋亡〔20〕。

ERK激活后磷酸化成為p-ERK，可將細胞信號從表面受體傳導至細胞核，參與細胞生長、分化、分裂等多種生物過程〔21〕。ERK存在于細胞質中，被激活后移位于細胞核，調節細胞代謝和功能，參與腫瘤的發生發展〔22〕。研究表明〔23，24〕，調節ERK可增強鼻咽癌、非小細胞肺癌細胞放射敏感性。

綜上，Ori可通過阻滯BCPAP細胞周期，調節凋亡相關蛋白表達誘導細胞凋亡，調控ERK通路增強細胞放射敏感性。這一研究有助于進一步了解甲狀腺癌發病機制，為甲狀腺癌的臨床治療提供新靶點。