硫氧還蛋白-1通過調控IRE1-JNK信號通路改善血管性癡呆大鼠認知功能和神經損傷

余秀 易琳琳 王悅

(內江市第一人民醫院神經內科，四川 內江 641000)

血管性癡呆(VD)被認為是繼阿爾茨海默病之后最常見的癡呆類型〔1，2〕。據預測，到2040年全球癡呆病人將達到8 110萬例，其中中國癡呆病人將是所有發達國家癡呆病人的總和〔3〕。包括肌醇酶(IRE)1-c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路介導的內質網應激在內的氧化應激被認為在VD發病機制中起重要作用〔4〕。硫氧還蛋白(Trx)-1是一種重要的二硫化還原酶，在控制細胞氧化還原狀態中起重要作用〔5〕。本實驗研究Trx-1過表達對VD模型大鼠海馬組織神經損傷的保護及認知能力的改善作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料 50只6～7周齡SPF級健康雄性SD大鼠，體重(260±20)g，購自長沙市天勤生物技術有限公司。動物許可證號：SCXK(湘)2014-0010。HEK293T人胚腎上皮細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。Trx-1重組慢病毒質粒pLV-EF1a-EGFP(2A)-Puro-Trx-1及包裝質粒PH1、PH2由北京英茂盛業生物科技有限公司設計并構建；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；DMEM培養基及胎牛血清購自Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自上海拜力生物科技有限公司；IRE1靶向抑制劑KIRA6購自美國MedChemExpress公司；全蛋白提取、二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量測定試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒、原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；超敏電化學發光試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；兔抗人Trx-1多克隆抗體、兔抗人磷酸化IRE1〔p-IRE1(S724)〕多克隆抗體購自英國Abcam公司；小鼠抗人磷酸化JNK〔p-JNK(Thr183/Tyr185)〕單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G和HRP標記的山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。Morris水迷宮購自北京智鼠多寶生物科技有限責任公司產品；光學顯微鏡購自日本Olympus公司產品；HHQ-2158輪轉式切片機購自杭州艾普儀器設備有限公司產品；Tanon-4100全自動數碼凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司產品。

1.2HEK293T細胞的培養及Trx-1重組慢病毒的制備 將HEK293T細胞置于含有100 ml/l FBS、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM中，37℃、5%CO2的培養箱中培養。轉染前，取生長狀態良好的處于對數生長期的HEK293T細胞，提前2 d接種于培養皿中。更換新鮮培養基，取5 μg Trx-1重組慢病毒質粒pLV-EF1a-EGFP(2A)-Puro-Trx-1、3.75 μg輔助質粒PH1和1.25 μg PH2質粒與相應體積的Opti-MEM混合均勻，總體積為2.5 ml，于室溫下孵育5 min，以空載重組質粒作陰性對照。取100 μl LipofectamineTM2000與2.4 ml Opti-MEM混合，室溫孵育5 min。再將兩種Opti-MEM混合液混合形成轉染復合物，共轉染HEK293T細胞。轉染72 h后，收集細胞上清液，離心、過濾。上清液于4℃、25 000 r/min離心2 h，所獲病毒分別命名為Lv-Trx-1〔病毒滴度：1.1×108轉導單位(TU)/ml〕和Lv-NC(病毒滴度：0.9×108TU/ml)，-80℃保存備用。

1.3雙側頸總動脈夾閉再通法構建VD大鼠模型 參照王蕊等〔6,7〕推薦的方法進行造模。大鼠適應性喂養1 w后，采用2%的戊巴比妥鈉(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，后仰臥位將大鼠固定于手術臺上，頸部皮膚剪毛暴皮，常規消毒處理；采用手術刀于頸正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈，隨機用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈，夾閉10 min再通10 min，重復一次；后在手術切口處施以適量青霉素消毒并縫合傷口，放回籠中日常飼養。

1.4動物分組及干預 按體重將SD大鼠隨機分成假手術組(Sham組)、模型組(VD組)、Trx-1過表達空載慢病毒干預組(VD/Lv-NC組)、Trx-1過表達慢病毒干預(VD/Lv-Trx-1組)及肌醇酶(IRE)1抑制劑KIRA6干預組(VD/KIRA6組)各10只。各干預組及模型組建立VD模型。VD/Lv-NC及VD/Lv-Trx-1組在造模前24 h側腦注射對應慢病毒溶液0.2 ml；VD/KIRA6組在造模前2 h側腦注射KIRA6溶液(劑量10 mg/kg)；Sham及VD組則注射等量生理鹽水。

1.5Morris水迷宮實驗檢測認知能力〔8〕造模24 h 后，參照參考文獻對各組進行Morris水迷宮實驗檢測認知能力。其中定位航行實驗主要記錄實際逃避潛伏期；而后續的空間探索實驗則記錄120 s內跨越原平臺的次數。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色觀察腦組織海馬區病理變化〔9〕水迷宮實驗結束后，斷頭處死各組并取腦組織，區視交叉后至小腦前部分，作兩道垂直切口，剝離海馬區，并分成兩等份。一部分保存于4%多聚甲醛固定48 h，另一部分-80℃凍存備用。取固定48 h的海馬區標本，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作病理切片(厚度3～5 μmol/L)。將石蠟切片依次再經脫蠟、HE染色、分化及藍化后HE染色、洗滌脫水及透明后封片。光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.7TUNEL染色檢測海馬區細胞凋亡〔10〕將海馬區石蠟切片依次進行TUNEL染色處理：烤片和脫蠟；水化；蛋白酶K工作液常溫孵育15～30 min；滴加50 μl TUNEL反應混合液于樣品上，在濕盒、暗室中37℃避光孵育60 min；用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；加入50 μl轉化劑POD于樣品上，在濕盒中37℃避光孵育30 min；用PBS沖洗3次；加入100 μl DAB底物，于15～25℃孵育10 min；用PBS沖洗3次；HE復染、脫水、透明；封片，光鏡下隨機選擇5個視野，陽性染色的細胞核成棕褐色，即凋亡細胞，凋亡率以高倍鏡下計數1 000個細胞中陽性細胞百分比表示。

1.8Western印跡檢測蛋白表達〔11〕取-80℃凍存的海馬組織，分別進行蛋白提取后進行濃度檢測；取20 μg蛋白和4 μl 2×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入一抗在4℃下，孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標記的二抗IgG室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用電化學發光進行顯色。以GAPDH為內參蛋白，后采用Quantity One圖像處理軟件對各指標灰度值進行半定量分析。

1.9統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、Tukey檢驗。

2 結 果

2.1各組認知能力比較 與Sham組比較，VD組逃避潛伏期顯著延長、跨越原平臺次數顯著減少(P<0.01)；與VD組比較，VD/Lv-Trx-1組及VD/KIRA6組逃避潛伏期顯著縮短、跨越原平臺次數顯著增多(P<0.01)，見表1。

表1 各組Morris水迷宮實驗結果

與Sham組比較:1)P<0.01;與VD組比較:2)P<0.01；下表同

2.2各組海馬區病理改變比較 Sham組腦組織海馬區錐體細胞形態結構完整，輪廓清晰可見，排列整齊，細胞數目多，核仁明顯，胞質豐富；VD組與VD/Lv-NC組腦組織海馬區病理改變類似，錐體細胞排列雜亂，基質疏松，細胞脫失顯著，部分細胞出現核固縮、溶解等現象；而VD/Lv Trx-1組及VD/KIRA6組海馬區病變稍輕微，僅少量錐體細胞變性、脫失或核固縮，錐體細胞排列較整齊，核仁較清晰，見圖1。

圖1 各組海馬區病理學變化(HE，×200)

2.3各組海馬區細胞凋亡情況比較 與Sham組〔(5.01±0.24)%〕比較，VD組〔(25.41±2.36)%〕差異顯著升高(P<0.01)；與VD組比較，VD/Lv-Trx-1組〔(10.15±1.24)%〕和VD/KIRA6組〔(9.48±0.89)%〕均顯著降低(P<0.01)。VD/Lv-NC組神經細胞凋亡率為〔(22.78±1.87)%〕。

2.4各組海馬區Trx-1、p-IER1和p-JNK蛋白相對表達水平 與Sham組比較，VD組Trx-1蛋白表達顯著降低(P<0.01)，p-IRE1和p-JNK水平顯著升高(均P<0.01)。與VD組比較，VD/Lv-Trx-1組和VD/KIRA6組Trx-1蛋白表達顯著升高(P<0.01)，p-IRE1和p-JNK水平顯著降低(均P<0.01)，見表2。

表2 各組海馬區Trx-1、p-IER1和p-JNK蛋白相對表達水平

3 討 論

研究顯示，缺血性神經元損傷發生的同時，Trx-1的表達會發生明顯變化。在大腦中動脈閉塞(MCAO)模型中發現，Trx-1的表達及免疫活性降低〔12〕。而Trx-1過表達明顯改善缺血再灌注所致的神經元損傷〔13〕。相反，Trx-1-siRNA對于缺血再灌注的干預則增加了模型動物神經功能缺損、腦梗死和腦積水〔14〕。因此猜測過表達Trx-1同樣能改善VD模型大鼠的認知能力和神經損傷。

Morris水迷宮實驗是目前世界上公認的較為客觀的認知能力評價方法。本研究提示Trx-1過表達與IRE1抑制劑KIRA6均能改善VD大鼠的認知能力，對VD起一定的治療作用。HE染色結果同樣也說明了這一點。

細胞凋亡是一種重要的生命現象，不僅出現在生理狀態下，更與包括VD在內的多種疾病發生密切相關〔15〕。而內質網應激可啟動細胞凋亡，這是近年才發現的一條新的細胞凋亡信號傳導通路〔16〕。在內質網應激反應早期，IRE1被激活并具有核酸內切酶活性，引導蛋白正確折疊，使細胞恢復正常狀態；但如果應激繼續加重，IRE1就會激活JNK激酶誘發細胞凋亡〔17〕。在本研究中發現，Trx-1過表達顯著抑制了VD大鼠海馬區神經細胞的凋亡，且IRE1抑制劑KIRA6干預同樣抑制了海馬區神經細胞的凋亡；此外，免疫印跡檢測結果顯示Trx-1過表達與IRE1抑制劑KIRA6均能顯著抑制VD大鼠IRE1-JNK信號通路的激活。綜上，慢病毒介導的Trx-1過表達能顯著保護VD大鼠的神經損傷、改善認知功能障礙，且這一效應可能與抑制內質網應激相關信號通路IRE1-JNK的活化有關。