高脂飼料結合慢性應激致大鼠非酒精性脂肪肝的藥物治療

孫紅爽 乜春城 李鵬霖 劉永雙 高玲娜

(衡水市人民醫院，河北 衡水 053000)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗、糖尿病、肥胖等代謝高危因素密切相關的應激性肝損傷，主要病理特征為脂肪在肝細胞內的過度沉積〔1〕。根據NAFLD的病程發展可以分為單純性脂肪肝變性、脂肪性肝炎、肝臟纖維化、肝硬化及肝癌〔2〕。目前對于NAFLD的治療并沒有特效制劑，生活方式的改變是首要的，藥物治療多是針對其并發癥如肥胖、糖尿病、血脂紊亂、高血壓和炎癥等〔3〕。前期研究，通過高熱量飼料結合慢性應激成功建立NAFLD大鼠模型，該模型伴隨明顯的氧化應激和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)亢進〔4，5〕。因此，本研究主要從改善這兩方面病變進行針對性藥物治療，選用“萬能抗氧化劑”α-硫辛酸(LA)或抑制促腎上腺皮質激素(ACTH)釋放藥物賽庚啶(CYP)分別對高脂飼料結合慢性應激引起的大鼠NAFLD模型進行藥物治療，以觀察兩種藥物對NAFLD模型的治療作用特點。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)測定試劑盒均購自長春匯力生物技術有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、游離脂肪酸(FFA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子(TNF)放射免疫分析試劑盒、皮質醇放射免疫分析試劑盒、ACTH放射免疫分析試劑盒均購自北京北方生物技術研究所； T6紫外分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司；M-96型16管手動放射免疫γ計數器購自合肥眾成生物工程設備有限公司；聚合酶鏈反應(PCR)儀(GeneAmp PCR System 9600)購自美國Applied Biosystems公司。

1.2動物與分組 32只Wistar雄性大鼠，清潔級，購自揚州大學實驗動物中心，體重150～200 g，生產許可證號：SCXK滬2002-0002。動物單籠恒溫(23±2)℃、恒濕(60%±5%)飼養，明暗周期12 h，自由飲水取食。適應性喂養1 w后，所有大鼠隨機分為對照組、模型組、LA組、CYP組各8只。對照組喂以普通飼料，其他3組喂以自制高脂飼料并輔以慢性應激刺激。高脂飼料配方為22%豬油+8%糖+2%膽固醇+2%食鹽+66%基礎飼料。慢性應激刺激采用足底電擊輔以噪聲刺激的方式，每日上、下午各2 h，方法同前期研究〔6〕。連續刺激8 w后，各組在高熱量飼料結合慢性應激刺激的同時，LA組以100.0 mg/(kg·d)LA灌胃，CYP組以2.30 mg/(kg·d)CYP灌胃。所用藥物以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配成相應濃度的混懸液，模型組及對照組灌胃給以相同體積的0.5%CMC-Na 溶液，均給藥4 w。

1.3肝指數的測定 給藥4 w后禁食12 h，稱重，腹腔注射20%烏拉坦注射液麻醉(0.5 ml/100 g)。頸動脈插管取血，全血3 500 r/min離心10 min獲得血清，-20℃冰箱保存。取肝臟，以4℃預冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分，稱取肝臟重量。肝指數(HI)=肝臟重量(g)/體重(g)×1000。

1.4血液學指標的測定 血清皮質醇、ACTH和TNF-α用DFM-96型16管放射γ免疫計數器檢測；血清TC、TG、HDL-C及FFA用比色法檢測；MDA用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測，SOD用羥胺法檢測。

1.5肝臟生化指標的測定 0.2 g肝組織放入2 ml生理鹽水中，4℃下勻漿，制成10%肝組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，獲得上清液，于-20℃冰箱保存。用于測定肝組織TC、TG、FFA、SOD、MDA及TNF-α含量，測定方法參照試劑盒說明書。

1.6肝臟TNF-α mRNA表達的檢測 新鮮肝組織100 mg，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復漂洗，-80℃冰箱凍存，用于測定肝臟TNF-α mRNA表達。TNF-α引物：上游5′-CAGACCCTCACACTCAGATCA-3′，下游5′ TCTCCTGGTATGAAATGGCA，引物長度270 bp。PCR反應條件為94℃，30 min預變性，然后94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s；運行30個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像分析系統灰度掃描，計算各組相對灰度。相對灰度=各組泳道灰度/對應泳道內參灰度。

1.7肝組織形態學觀察 將動物新鮮肝組織在4℃的PBS中反復漂洗，在10%中性甲醛中固定，酒精梯度脫水，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。參照NASH臨床研究評分系統〔7〕，從5個方面評價肝組織病變程度，即脂肪變性(肝細胞脂肪變性<5%計0分，5%～33%計1分，34%～66%計2分，>66%計3分)、小葉炎癥(放大200倍視野下，無炎癥計0分，炎癥<2個計1分，2～4個計2分，>4個計3分)、匯管區炎癥(在低放大倍數下無到極輕的炎癥計0分，大于極輕的炎癥計1分)、肝細胞氣球樣變(無計0分，少數細胞氣球樣變計1分，多數細胞氣球樣變或顯著的氣球樣變計2分)和肝組織纖維化(竇周狀或門靜脈周圍的計1分，弱的、3區、竇周狀的計1分，中等的、3區、竇周狀的計1分，門靜脈或門靜脈周圍的計1分，竇周狀的和門靜脈/門靜脈周圍的計2分，橋連的纖維化計3分，硬化計4)。參照Matteoni等〔8〕的建議將病理切片進行分為4個級別：1級，單純肝細胞脂變；2級，肝細胞脂變并伴小葉炎癥；3級，肝細胞脂變并伴氣球樣變；4級，肝細胞脂變并伴氣球樣變、肝細胞內出現Mallory小體或肝纖維化。

1.8統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組給藥4 w后HI比較 與對照組〔(23.12±1.13)mg/g〕比較模型組〔(25.71±1.09)mg/g〕、LA組〔(24.57±1.53)mg/g〕及CYP組HI〔(25.16±0.89)mg/g〕均明顯增大(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，LA組及CYP組HI均無明顯差異(P>0.05)。提示，LA或CYP治療對HI的增大沒有明顯的抑制作用。

2.2血液生化指標檢測結果

2.2.1表示HPA軸激活程度的指標——血漿皮質醇和ACTH 與對照組比較，模型組、LA組及CYP組皮質醇、ACTH濃度均明顯升高(P<0.01)，CYP組顯著小于模型組(P<0.01)，但LA組與模型組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.2.2氧化應激指標——血清SOD及MDA 與對照組比較，模型組、LA組及CYP組 SOD活力均明顯下降(P<0.05，P<0.01)，MDA濃度均明顯升高(P<0.01)；LA組SOD活力明顯高于模型組且MDA濃度明顯低于模型組(P<0.01)；CYP組SOD活力與模型組無明顯差異(P>0.05)，但MDA濃度明顯小于模型組(P<0.05)。見表1。

2.2.3血脂檢測結果 與對照組比較，模型組及CYP組TC濃度明顯升高(P<0.01，P<0.05)，模型組TG濃度明顯升高(P<0.01)，各組HDL-C均明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，LA組及CYP組TC濃度均明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)，CYP組TG濃度明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，LA組和CYP組HDL-C與模型組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.2.4血液FFA檢測結果 與對照組比較，模型組、LA組及CYP組血FFA濃度均明顯升高(P<0.01)；LA組及CYP組明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2.5血漿TNF-α檢測結果 與對照組比較，模型組、LA組及CYP組TNF-α濃度均明顯升高(P<0.01)；LA組及CYP組明顯低于模型組(P<0.01)。見表1。

表1 治療后4組生化指標比較

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05.4)P<0.01；下表同

2.3肝組織生化指標 與對照組比較，模型組、LA組及CYP組肝組織TNF-α含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，LA組及CYP組肝組織TNF-α均明顯下降(P<0.01)。與對照組比較，模型組、LA組及CYP組肝組織SOD活力均明顯下降(P<0.01)，MDA含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01)；LA組SOD活力明顯高于模型組(P<0.01)，CYP組則與模型組無明顯差異(P>0.05)，而LA、CYP組MDA含量均明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)。與對照組比較，模型組及CYP組肝組織TC、TG含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，LA組TC、TG含量均明顯低于模型組(P<0.01)，CYP組兩指標與模型組無明顯差異(P>0.05)。與對照組比較，模型組、LA組及CYP組肝組織FFA含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)；LA組及CYP組明顯低于模型組(P<0.01)。見表2。

表2 治療后各組肝組織生化指標比較

2.4肝組織TNF-α mRNA表達 與對照組(0.052±0.008)比較，模型組(0.043±0.004)及LA組TNF-α mRNA表達(0.137±0.022)顯著升高(P<0.01)，CYP組(0.085±0.005)與對照組無在顯著差異(P>0.05)；與模型組比較，LA組及CYP組TNF-α mRNA表達均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。見圖1。

圖1 肝組織TNF-α mRNA表達

2.5肝組織切片觀察 對照組肝細胞結構完整、清晰，肝小葉結構清楚，所有動物都未顯示有病變跡象；模型組8只動物中有7只存在輕度或中度脂變，4只有匯管區輕度炎癥，3只有輕度肝細胞氣球樣變，4只有輕度肝纖維化，所有動物均未見小葉炎癥；LA組8只動物中有5只出現輕度脂變，2只出現輕度匯管區炎癥，2只有輕度肝細胞氣球樣變，3只有輕度肝纖維化，所有動物均未發現小葉炎癥；CYP組8只動物1只有輕度脂變，1只有肝纖維化，而所有動物均未見小葉炎癥、匯管區炎癥及肝細胞氣球樣變形。見圖2。

圖2 各組肝組織切片(HE染色)

3 討 論

LA是一種超強生物抗氧化劑，兼具親水和親脂兩種特性，在水溶性和脂溶性環境中均有較好的抗氧化作用。LA易經消化道吸收，在體內部分轉化為抗氧化活性更強的二氫硫辛酸(DHLA)，分布到機體組織中發揮抗氧化作用，并且可以通過血腦屏障，減少中樞神經系統的氧化損傷。LA的抗氧化作用主要體現在以下3個方面：①清除自由基和活性氧：LA 能夠有效清除羥基及一氧化氮自由基、過氧化氫、單線態氧、次氯酸及過氧化亞硝基。雖然LA 不能清除超氧自由基和過氧化物自由基，但DHLA對單線態氧以外的其他自由基均有清除作用。由于體內LA和DHLA同時存在，因此，上述所有自由基均可被有效清除；②鰲合金屬離子：LA能夠螯合Fe、Cu及其他過渡金屬元素(Mn2+、Cd2+、Zn2+等)，減少細胞內羥基自由基(·OH)的產生，進而阻斷脂質過氧化；③再生內源性抗氧化劑：LA和 DHLA在體內的相互轉化能再生維生素C、維生素E、谷胱甘肽、硫氧還原蛋白及泛醌等抗氧化劑，使這些抗氧化劑由氧化型轉化為還原型〔9〕。

自1980 年德國的Sachse首次將LA應用到臨床后，該藥逐漸引起醫學界重視，僅糖尿病領域，人們已廣泛應用LA的強抗氧化應激能力，保護β細胞，延緩其衰減，減輕對其的攻擊；保護肌肉、脂肪細胞，增強對葡萄糖的利用，增強胰島素敏感性；保護神經細胞，改善糖尿病神經病變；保護內皮細胞，減少動脈粥樣硬化等〔10，11〕。近年來也有學者嘗試將LA應用于NAFLD的治療，結果顯示LA可從多個環節阻止氧應激和脂質過氧化反應，從而改善大鼠肝功能，是治療脂肪肝的有效藥物〔12，13〕。

CYP是一種非選擇性5-羥色胺(HT)受體阻斷劑，并且能夠阻斷組胺H1受體，屬于第二代抗組胺藥。CYP通過拮抗中樞特異性5-HT受體，減少促ACTH釋放因子(CRF)的釋放，進而使血漿ACTH、皮質醇濃度下降，降低HPA軸的反應活性，臨床用于治療腎上腺皮質功能亢進癥。CYP也可抑制左旋多巴誘發的ACTH釋放，使血漿ACTH氫化可的松反應。此外，研究發現該藥有鈣通道阻滯、自由基清除、抗感染、解熱鎮痛等作用〔14〕。王冰等〔15〕報道，外源性糖皮質激素能引起大鼠HPA軸過度激活，肝脂代謝紊亂，加劇肝臟脂質沉積，誘發大鼠肝脂肪變性。CYP可干擾HPA軸的過度激活，降低血清ACTH和皮質醇水平，逆轉外源性糖皮質激素引起的大鼠肝功能損傷，改善糖脂代謝紊亂。

本研究結果顯示，LA和CYP對高熱量飼料結合應激引起的大鼠NAFLD均有治療作用，表現為血脂紊亂及肝臟脂質沉積改善、血液及肝組織TNF-α表達降低、氧化應激狀態改善、HI下降。但兩者對該模型的治療效果也存在差異：CYP可明顯抑制HPA軸過分激活，LA不能；LA的抗氧化應激效果好于CYP。肝組織切片觀察顯示，CYP治療對該模型肝損傷的改善較明顯，可明顯改善肝脂肪沉積、肝細胞氣球樣變、匯管區炎癥等癥狀。本研究只是兩種不同作用機制藥物對NAFLD治療的初步探索，進一步研究可觀察兩種藥物對胰島素抵抗、心血管系統損傷及脂肪組織病變等相關疾病的治療作用，為NAFLD及其相關疾病的臨床治療提供新思路。