抑制EphA7表達(dá)對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

金紅 莫迪 李夢雨 楊嵐 張黎 武艷 季洪良 富宏然

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 牡丹江 157011；2 牡丹江醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院；牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 3眼科；4科研科； 5牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心)

根據(jù)組織學(xué)特征肺癌可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌。雖然空氣污染、煙草煙霧等多種因素都能增加肺癌的發(fā)病率，但肺癌形成的機(jī)制尚不清楚〔1,2〕。轉(zhuǎn)移是癌癥的致死特征之一，約占人類癌癥死亡的90%〔3〕，肺癌轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜過程，包括細(xì)胞遷移、局部浸潤和播散，阻斷其中步驟之一能夠有效地防止繼發(fā)性腫瘤在體內(nèi)擴(kuò)散〔4,5〕。受體酪氨酸激酶(RTKs)為細(xì)胞增殖、分化和遷移的主要調(diào)控因子〔6〕。抑制酪氨酸蛋白激酶受體(Eph)代表最大的RTKs家族，并與ephrins配體相互作用。研究證實(shí)RTKs可參與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和新血管的形成〔7,8〕。本研究用小干擾RNA(siRNA)沉默EphA7，研究其對非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1一般材料 人肺腺癌NCI-H1975細(xì)胞株購自中國上海中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，轉(zhuǎn)染試劑盒細(xì)胞凋亡試劑購自美國Promega公司，CCK8檢測試劑盒購自中國海門碧云天生物技術(shù)研究所，抗EphA7抗體、抗B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、抗蛋白酪氨酸磷酸酶(PTEN)抗體、抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、抗蛋白激酶B(AKT)抗體和抗磷酸化(p)-AKT抗體購自美國Abcam。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 NCI-H1975細(xì)胞復(fù)蘇后，待細(xì)胞生長到一定數(shù)量后，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)以后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，按每孔0.1 ml接種于96孔板上，37℃、5%CO2條件進(jìn)行培養(yǎng)。將NCI-H1975細(xì)胞分為3組，抑制組和NC組分別轉(zhuǎn)染EphA7抑制劑和EphA7-NC,空白對照組不轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞以5×105個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，然后向其中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁生長并達(dá)80%時(shí)，每孔加入10 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO置于搖床上低速震蕩10 min，然后在490 nm波長下用酶標(biāo)儀測定每個(gè)樣本的吸光度(OD)值，每個(gè)樣品重復(fù)做3次。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測EphA7 mRNA的表達(dá) 從每個(gè)樣品中提取總RNA(1 μg)利用逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)可生成cDNA。使用SYBR Green PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。EphA7引物序列：上游5′-CTAATGTTGGATTGTTGGCAAAAG-3′，下游5′-TTGATCCAGAAGAGGGCTTATTG-3′；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游 5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′，下游5′-TCCACCACCCAGTTGCTGTA-3′。反應(yīng)條件：95℃15 s，60℃ 30 s和72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，數(shù)據(jù)用Sequence detection software1.3系統(tǒng)處理，用2-ΔΔCt給出EphA7 mRNA的相對值。

1.5用末端轉(zhuǎn)移酶的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色法檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞用4%多聚甲醛在室溫下固定30～60 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用含0.1% Triton X-100的枸櫞酸鈉緩沖液浸透，冰浴孵育2 min，用PBS洗滌2次，加入50 μl原位凋亡檢測試劑盒的TUNEL檢測液，細(xì)胞核與4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，于37℃下避光孵育60 min，用PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，激發(fā)光波長范圍450～500 nm，發(fā)射波長范圍515～565 nm(綠色熒光)，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率(凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))。

1.6采用 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲與遷移 (1)細(xì)胞在37℃孵育24 h后收集各組處理后的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，并將濃度為5×105個(gè)/ml細(xì)胞接種到Transwell小室中，向小室內(nèi)加入含有10%胎牛血清培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)沒有被侵襲的細(xì)胞，棄掉下室液體，下室已經(jīng)被侵襲的底層細(xì)胞用95%乙醇固定，0.2%結(jié)晶紫染色1 h，純水輕輕洗小室底部，顯微鏡下每孔取左上、右上、中、左下、右下5個(gè)視野拍照(固定位置，排除主觀選擇因素)，對圖片上被染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。(2)細(xì)胞在37℃孵育24 h后收集各組處理后的細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，并將濃度為5×105個(gè)/ml細(xì)胞接種到Transwell小室中，上層室無血清，底部加入含有10%胎牛血清培養(yǎng)液，接著在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，用棉簽將上層沒有被侵襲的細(xì)胞清除，棄掉下室液體，下室已經(jīng)被侵襲的底層細(xì)胞用95%乙醇固定，0.2%結(jié)晶紫染色1 h，用純水輕輕洗小室底部，顯微鏡下每孔取左上、右上、中、左下、右下5個(gè)視野拍照(固定位置，排除主觀選擇因素)，對圖片上被染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7使用蛋白印跡法檢測信號通路蛋白表達(dá)水平 將藥物處理后的細(xì)胞收集加入裂解液，各組提取的總蛋白樣品30～90 μg在10%～15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，加入封閉液(5%脫脂奶粉)，浸泡被轉(zhuǎn)印膜，室溫反應(yīng)1 h，來封閉轉(zhuǎn)印膜上的一些非特異性蛋白質(zhì)的潛在結(jié)合位點(diǎn)，防止發(fā)生非特異性反應(yīng)；轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡；然后用第一抗體在4℃孵育過夜(抗PTEN抗體、抗GAPDH抗體、抗AKT抗體和抗p-AKT抗體)，棄一抗，用0.01 mol/L包含0.5% Tween20的PBS分別洗膜，10 min×3次，振蕩；加入熒光標(biāo)記的二抗溶液，室溫下反應(yīng)1 h，保持平緩搖動(dòng)；棄二抗，用0.01 mol/L PBS洗膜，10 min×4次，振蕩。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色：將膜浸于ECL發(fā)光液中，避光顯色3 min，將膜用濾紙吸干，以β-actin作為內(nèi)參對照，用Tanon5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組EphA7 mRNA及蛋白表達(dá) 與空白對照組比較，抑制組EphA7 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯減少(P<0.05，P<0.01)，見表1，圖1。

表1 各組EphA7 mRNA及蛋白表達(dá)水平

與空白對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；下表同

圖1 各組EphA7蛋白表達(dá)水平

2.2抑制EPHA7表達(dá)對各組細(xì)胞增殖抑制作用 與空白對照組比較，抑制組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，見圖2，表2。

圖2 抑制EphA7表達(dá)對各組細(xì)胞凋亡的影響(×100)

表2 抑制EphA7表達(dá)對各組細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡率的影響

2.3抑制EphA7表達(dá)對各組細(xì)胞的侵襲和遷移的影響 與空白對照組比較，抑制組的侵襲和遷移的細(xì)胞數(shù)明顯較少(均P<0.05)，見表3。

表3 抑制EphA7表達(dá)對各組細(xì)胞的侵襲和遷移的影響

2.4抑制EphA7表達(dá)對各組細(xì)胞信號通路蛋白(AKT、p-AKT和PTEN)表達(dá)水平的影響 與空白對照組比較，抑制組的PTEN蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，總AKT蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4、圖3。

表4 抑制EphA7表達(dá)對各組細(xì)胞信號通路蛋白表達(dá)水平的影響

1～3:空白對照組，NC組，抑制組圖3 抑制EphA7表達(dá)對各組細(xì)胞的信號通路蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

目前，肺癌晚期患者病死率較高，與肺癌晚期惡性腫瘤細(xì)胞強(qiáng)大的侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Eph受體和ephrin配體調(diào)控是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和不良結(jié)局的關(guān)鍵〔9～11〕，現(xiàn)已證實(shí)EphA7在腎血管系統(tǒng)中高度表達(dá)，EphA7的表達(dá)在肺癌組織中也被轉(zhuǎn)錄激活〔12〕，但很少有研究闡明EphA7在腫瘤致病性中的作用，本研究首次證明了沉默EphA7可以抑制NCI-H1975細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞的遷移與侵襲，并在NCI-H1975細(xì)胞中通過上調(diào)PTEN抑制AKT信號通路。

在正常情況下，機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞分裂和增殖受到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級聯(lián)調(diào)控，如果信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的促進(jìn)生長和抑制生長的平衡作用遭到破壞，就會導(dǎo)致細(xì)胞的增殖失控和惡性轉(zhuǎn)移。目前細(xì)胞中的膜受體Eph(ras-MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、蛋白酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(JAK-STAT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖失控與惡性轉(zhuǎn)移中起重要作用，與惡性腫瘤晚期的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。信號通路調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生如細(xì)胞遷移和侵襲等密切相關(guān)，是目前腫瘤治療的靶點(diǎn)，對信號通路進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)是治療腫瘤的關(guān)鍵。AKT/mTOR/STAT3信號通路在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長、侵襲和凋亡中起重要作用〔13〕。AKT的活化減少，從而抑制信號通路達(dá)到抑制細(xì)胞生長和增殖的作用，降低了癌細(xì)胞增殖和凋亡抵抗。PI3K/AKT通路是癌癥發(fā)展的一個(gè)重要信號通路和代謝途徑。

本研究結(jié)果表明，EphA7的沉默下調(diào)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中PTEN-AKT信號通路。此外，siEphA7作為腫瘤抑制因子調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲和遷移。