早期反應基因在宮頸癌中表達及其與人乳頭瘤病毒感染的關系

李素芳 徐宏仙 莫政 黎世貴 萬妮婭

(三亞市中醫院，海南 三亞 572000)

宮頸癌是中老年女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發生與分娩次數、性行為開始時間和頻率、家族遺傳等多種因素有關，其中高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是最主要的危險因素〔1〕。研究者發現，約95%的宮頸癌患者可檢出高危型HPV，其中HPV16、HPV18是最常見的兩個亞型〔2〕。早期反應基因(Iex-1)最先由研究者在小鼠成纖維細胞中發現，當受到多種刺激后，可迅速短暫性表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學效應〔3〕。已有研究發現，多種人體惡性腫瘤中存在Iex-1表達失調〔4〕；但關于宮頸癌細胞和組織中Iex-1表達研究較少，且與高危型HPV感染是否相關尚未闡明。本研究以不同宮頸病變組織標本和3種不同HPV感染情況的宮頸癌細胞系為研究對象，探討宮頸癌組織和細胞中Iex-1表達特點及與高危型HPV感染的相關性。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集2016年1月至2018年3月三亞市中醫院病理科留存的宮頸病變組織石蠟包塊61份，其中宮頸良性病變13例，年齡48～72歲，平均(52.87±10.02)歲。宮頸上皮內瘤變23例，Ⅰ級9例、Ⅱ級8例、Ⅲ級6例，年齡46～70歲，平均(54.27±9.73)歲。宮頸癌25例，宮頸癌國際婦產科聯盟(FIGO)臨床病理分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期10例、Ⅲ期5例、Ⅳ期2例；分化程度：高分化9例、中分化8例、低分化8例。上述患者均接受放化療和生物治療；本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2細胞與試劑 人宮頸癌細胞株C-33A(HPV-)、SIHA(HPV16+)、HELA(HPV18+)購于上海鈺博生物科技有限公司。Iex-1免疫組化試劑盒購于南京賽泓瑞生物科技有限公司。細胞總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒購于上海澤葉生物科技有限公司。兔抗人Iex-1多克隆抗體、鼠抗人E6單克隆抗體、羊抗兔IgG二抗、兔抗鼠IgG二抗購于上海康朗生物科技有限公司。

1.3免疫組化法檢測宮頸病變組織中Iex-1表達 采用免疫組化SP法檢測，宮頸病變組織石蠟包塊4 μm連續切片，染色步驟嚴格按試劑盒說明。光學顯微鏡下觀察陽性細胞比例和染色強度，進行半定量評分。其中陽性細胞比例<5%計0分，5%～25%計1分，>25%且≤50%計2分，>50%且≤75%計3分，>75%計4分；無染色不計分，淡黃計1分，棕黃計2分，褐色計3分。陽性細胞比例和染色強度評分的乘積為最終得分，陰性(0分)、弱陽性(1～4分)、陽性(5～8分)、強陽性(9～12分)。

1.4實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測宮頸癌細胞株中Iex-1 mRNA表達 Triozl法提取C-33A、SIHA、HELA宮頸癌細胞株總RNA，逆轉錄得到cDNA，Iex-1、β-actin引物合成由上海澤葉生物科技有限公司完成。引物序列：Iex-1上游5′-GAGCTCCATCACTGTAGTCG-3′，下游：5′-TTAAGAGTTTCCC GTGAGCT-3′；β-actin上游5′-CATTCCCTACAATGACGTCGGTTGTG-3′，下游：5′-ATAGCAACGGGATACGGGATAGCGGT-3′。反應體系30 μl，條件：94℃ 10 min，94℃ 5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共40個循環，72℃延伸10 min。計算Iex-1 mRNA相對表達量。

1.5Western印跡法檢測宮頸癌細胞株中Iex-1蛋白表達 C-33A、SIHA、HELA宮頸癌細胞株中加入蛋白裂解液，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量，蛋白濃度調整至4 μg/μl，分別取50 μl行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離目標蛋白，轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，膜封閉60 min，滴加兔抗人Iex-1多克隆抗體(1∶100)，以兔源性β-actin(1∶1 000)為內參，4℃孵育過夜，洗膜后滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)，室溫下靜置2 h，電化學發光(ECL)顯色，放入凝膠成像系統中讀取各條帶灰度值。

1.6siRNA制備與分組 由上海澤葉生物科技有限公司公司設計并合成HPV16 E6特異性siRNA序列和陰性序列siRNA-nc，分別轉染SIHA細胞，為干擾組和陰性對照組，并設立空白對照組，每組6個平行對照。

1.7siRNA干擾后SIHA細胞中E6和Iex-1 mRNA和蛋白表達檢測 轉染48 h后，Triozl法提取3組SIHA細胞中的總RNA，逆轉錄得到cDNA，E6引物序列：上游5′-GCTGACCTGAATCTCTAAC-3′，下游：5′-ATAATCCCACCGGCTACTA-3′；Iex-1上下游引物、反應體系和條件同1.4。轉染48 h后，提取3組SIHA細胞中蛋白質，定量后調整濃度至4 μg/μl，分別取50 μl行SDS-PAGE，分離目標蛋白，轉膜至PVDF，封閉60 min，滴加鼠抗人E6單克隆抗體(1∶500)、兔抗人Iex-1多克隆抗體(1∶100)，以兔源性β-actin(1∶1 000)為內參，4℃孵育過夜，洗膜后滴加HRP標記的兔抗鼠IgG二抗(1∶2 500)、羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)，室溫下靜置2 h，ECL顯色，放入凝膠成像系統中讀取各條帶灰度值。

1.8統計學分析 使用SPSS21.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1不同宮頸病變組織中Iex-1表達 宮頸良性病變、宮頸上皮內瘤變、宮頸癌組織中Iex-1表達陽性率依次顯著下降(P<0.01)。見表1。

表1 不同宮頸病變組織中Iex-1表達比較〔n(%)〕

2.2Iex-1表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系 Iex-1陽性率在不同病理類型、FIGO分期的宮頸癌患者中差異無統計學意義(P>0.05)；分化程度為G1～G2的宮頸癌患者Iex-1陽性率明顯高于分化程度為G3的患者(P<0.05)；無宮旁浸潤、有淋巴結轉移的宮頸癌患者Iex-1陽性率明顯高于宮旁浸潤、無淋巴結轉移的患者(P<0.05)。見表2。

表2 Iex-1表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關系〔n(%)〕

2.3不同宮頸癌細胞株中Iex-1 mRNA和蛋白表達 不同HPV感染狀態的宮頸癌細胞株中，C-33A細胞株Iex-1 mRNA表達水平明顯高于SIHA、HELA細胞株(P<0.05)；C-33A細胞株Iex-1蛋白表達水平明顯高于SIHA、HELA細胞株(P<0.05)。SIHA細胞株和HELA細胞株Iex-1 mRNA和蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，圖1。

2.4siRNA干擾后SIHA細胞中E6和Iex-1 mRNA和蛋白表達 干擾組SIHA細胞中E6 mRNA和蛋白表達水平明顯低于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)；干擾組SIHA細胞中Iex-1 mRNA和蛋白表達水平明顯高于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)。空白對照組與陰性對照組E6 mRNA和蛋白、Iex-1 mRNA和蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表4。

表3 不同宮頸癌細胞株中Iex-1 mRNA和蛋白相對表達

與SIHA相比：1)P<0.05；與HELA相比：2)P<0.05

圖1 Western印跡法檢測不同宮頸癌細胞株中Iex-1蛋白表達

圖2 Western印跡法檢測SIHA細胞中E6、Iex-1蛋白表達

表4 siRNA干擾后SIHA細胞中E6和Iex-1 mRNA和蛋白相對表達

與空白對照組相比:1)P<0.05；與陰性對照組相比:2)P<0.05

3 討 論

我國每年約20萬例新發宮頸癌患者，約占全球新發患者總數的1/3〔5〕。中老年是宮頸癌的高發期，高危型HPV持續感染是宮頸癌發生的首要原因，其中16型和18型是最主要的宮頸癌致病HPV亞型〔6〕。在高危型HPV DNA向宿主基因組整合過程中可引發HPV主要癌蛋白E6持續高表達，通過多種途徑引發細胞周期紊亂，提升基因組不穩定性，降低細胞凋亡率〔7〕。Iex-1廣泛分布于人體各組織器官中，在不同類型腫瘤中發揮促進或抑制癌細胞增殖、轉移的雙重作用〔8〕。

本研究提示隨著宮頸病變程度的加重，Iex-1表達水平明顯下降甚至缺失，可能參與宮頸癌的發生、發展。同時也說明在宮頸癌細胞中Iex-1發揮抑癌因子作用，促進癌細胞凋亡、抑制增殖，臨床中可作為監測宮頸癌發展的生物學標志物。盡管高危型HPV是引發宮頸癌的危險因素已得到證實，但HPV致癌過程中相關的信號通路仍未完全闡明。P53、細胞外信號調節激酶(Erk)、蛋白激酶B(AKT)等多種因子參與了Iex-1及HPV E6信號通路〔9〕。

相關研究顯示，HPV E6蛋白與P53相互作用，參與正常細胞向癌細胞的惡性轉化〔10〕。Iex-1的啟動子區域中含有P53特異性結合位點，研究者發現，p53調節Iex-1表達的準確性和敏感性均較好，進而影響癌細胞增殖和凋亡〔11〕。亦有研究發現，HPV16 E6蛋白可明顯提升核因子(NF)-κB的活性亞基NF-κB P65表達水平〔12〕；HPV18 E6蛋白在調控HELA宮頸癌細胞核因子NF-κB P65表達及磷酸化方面發揮重要作用〔13〕。Iex-1基因的C端能夠與REL/P65特異性結合，抑制NF-κB靶基因BCL-xl、Clap1表達〔14〕；Iex-1還能夠抑制IΚBα降解，下調NF-κB表達水平〔15〕。上述兩個調控途徑均能夠抑制NF-κB的抗凋亡作用。

本研究顯示，HPV陽性的宮頸癌SIHA、HELA細胞株中Iex-1 mRNA和蛋白表達水平均明顯低于HPV陰性的宮頸癌C-33A細胞株；使用siRNA特異性沉默SIHA細胞中E6表達后，Iex-1 mRNA和蛋白表達水平明顯提升，提示宮頸癌組織中Iex-1表達與是否存在HPV感染有關，HPV可能經某些信號通路下調Iex-1表達，促進宮頸癌發展與轉移。本研究結論首次提出了抑制Iex-1的促凋亡作用可能為HPV誘發宮頸癌的新通路，通過特異性沉默宮頸癌細胞E6蛋白表達來提升Iex-1活性有望成為宮頸癌治療的新途徑。