單核細胞Toll樣受體和髓樣分化蛋白表達水平與T2DM神經病變患者炎癥反應的關系

鄭文龍 孟新顏 鄒亞君 王朝迅 常東

(1上海市浦東醫院檢驗科，上海 201399；2徐州市中心醫院神經內科；上海市浦東醫院 3老年醫學科；4內分泌科)

2型糖尿病(T2DM)可引發全身各系統慢性損傷和功能障礙，好發于老年人群，而糖尿病(DM)周圍神經病變(DPN)是最常見的并發癥之一，可影響局部神經的正常生理功能，引發一系列臨床綜合征，目前發病機制仍未明確〔1〕。相關研究顯示，DM發病和DPN與體內異常炎癥狀態有關〔2〕。單核細胞Toll樣受體(TLRs)激活后可通過髓樣分化蛋白(MyD88)信號通路分泌大量炎性因子，誘發體內免疫炎癥反應，TLR4是TLRs家族介導炎癥反應的主要受體〔3〕。陷窩蛋白-1是質膜微囊標志蛋白，可調控體內免疫炎癥反應〔4〕。本研究分析DPN患者外周血單核細胞中TLR4、MyD88表達情況，探討與神經病變的關系及作用機制。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2016年1月至2018年3月間上海市浦東區院收治的T2DM老年患者(年齡>45歲)210例，其中無神經病變(TDM組)120例，伴周圍神經病變(DPN組)90例。入選患者均依據世界衛生組織DM診斷和分型標準確診為T2DM；DPN組患者經神經電生理檢查證實神經纖維傳導減慢，且肢體末端存在麻木、痛覺過敏等癥狀。排除合并心、肝等重要器官功能障礙；入院前1個月內有感染性疾病或炎性病變史的患者。選取同年齡段健康志愿者100名為對照組。本研究經醫院倫理委員會審批，受試者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 DMEM培養基、胎牛血清購于上海杰美基因醫藥科技有限公司；Trizol試劑、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、白細胞介素(IL)-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購于廣州國奧生物技術有限公司；鼠抗人TLR4、陷窩蛋白-1、MyD88、IκB、p-IκB、β-actin單克隆抗體，山羊抗小鼠二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記購于北京百奧萊博科技有限公司。

1.3生化指標檢測 抽取受試者晨起空腹肘靜脈血10 ml，取其中4 ml用于檢測生化指標，全自動生化分析儀測定空腹血糖和血脂指標〔三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)〕；血紅蛋白測定儀檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)，散射比濁法檢測C反應蛋白(CRP)。

1.4單核細胞分離和促炎因子檢測 取另外6 ml外周靜脈血，4 000 r/min分離血細胞和血漿，收集血細胞并加入淋巴細胞分離液，獲取單核細胞，洗滌后加入含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基，細胞濃度調至1×106/L，接種于6孔板中，放入37℃ 5%CO2濃度的細胞培養箱中，孵育3 h，收集貼壁的單核細胞。血漿用于檢測促炎因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)，操作嚴格按ELISA試劑盒說明書進行。

1.5TLR4、陷窩蛋白-1 mRNA檢測 RT-PCR法進行檢測，Trizol提取單核細胞中總RNA，反轉錄得到cDNA，TLR4、陷窩蛋白-1、β-actin引物合成由上海權陽生物科技有限公司公司完成，TLR4引物序列：上游：5′-CACTCTCCTTCACTTTCGCC-3′，下游：5′-CACTCCTA CTACGGTCCTAC-3′；陷窩蛋白-1引物序列：上游：5′-CTTGTGTTACAACTCG GTG-3′，下游：5′-GGAAACGGGTCTTTCTTCT-3′；β-actin引物序列：上游：5′-GTTTCCACCTCCTCACCCAC-3′，下游：5′-GATGTCGTTGTCCCAC CACC-3′。總反應體系30 μl，反應條件：94℃ 10 min，94℃ 5 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共進行40個循環，72℃延伸10 min。擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳，掃描得到目標條帶灰度值，計算TLR4、陷窩蛋白-1 mRNA的相對表達量。

1.6TLR4、陷窩蛋白-1及下游信號蛋白檢測 Western印跡法進行檢測，外周血單核細胞中加入全蛋白提取液，離心取上清，BCA法蛋白定量，取目標蛋白加入適量緩沖液，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜到聚偏氧乙烯(PVDF)，5%脫脂奶粉封閉2 h后分別滴加鼠抗人TLR4單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人陷窩蛋白-1單克隆抗體(1∶500)、鼠抗人MyD88單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人IκB單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人p-IκB單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000)；4℃冷藏過夜，滴加HRP標記的小鼠抗人IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h，電化學發光(ECL)顯色，暗室中顯影、采集圖像，分析各條帶灰度值。

1.7統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行t檢驗及Spearman分析。

2 結 果

2.13組一般資料和生化指標比較 與對照組相比，TDM組和DPN組HbA1c、CRP明顯升高，其中DPN組升高程度更明顯(P<0.05)；3組性別、年齡、BMI、DM病程、TG、TC、LDL-C、HDL-C差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組受試者一般資料和生化指標比較

與對照組相比：1)P<0.05；與TDM組相比：2)P<0.05，下表同

2.23組血漿促炎因子濃度比較 3組血漿IL-1β、IL-6、TNF-α濃度差異有統計學意義(P<0.05)；其中TDM組、DPN組血漿IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯高于對照組，DPN組患者血漿IL-1β、IL-6、TNF-α濃度明顯高于TDM組(P<0.05)。見表2。

表2 3組血漿促炎因子濃度比較

2.33組TLR4、陷窩蛋白-1 mRNA表達水平比較 TDM組、DPN組患LR4、陷窩蛋白-1 mRNA相對表達量明顯高于對照組，TDM組TLR4 mRNA相對表達明顯低于DPN組，陷窩蛋白-1 mRNA相對表達量明顯高于DPN組(P<0.05)。見表3。

表3 3組TLR4、陷窩蛋白-1 mRNA表達水平

2.4相關性分析 DPN患者外周血單核細胞中TLR4 mRNA表達與血漿IL-1β、IL-6、TNF-α呈顯著正相關(r=0.597、0.831，均P<0.05)；TLR4 mRNA表達與陷窩蛋白-1 mRNA呈顯著負相關(r=-0.891，P<0.05)。

2.5各組TLR4、陷窩蛋白-1及下游信號蛋白表達水平比較 TDM組、DPN組外周血單核細胞中陷窩蛋白-1、IκB蛋白相對表達量明顯低于對照組，TLR4、MyD88、p-IκB蛋白相對表達量明顯高于對照組(P<0.05)。與TDM組相比，DPN組陷窩蛋白-1、IκB蛋白相對表達量明顯減少，TLR4、MyD88、p-IκB蛋白相對表達量明顯增加(P<0.05)。見表4，圖1。

表4 3組外周血單核細胞中TLR4、陷窩蛋白-1及下游信號蛋白表達水平比較

與對照組相比：1)P<0.05；與TDM組相比：2)P<0.05

圖1 各組TLR4、陷窩蛋白-1及下游信號蛋白Western印跡電泳條帶

3 討 論

免疫炎癥是DPN發病機制的重要組成部分〔5〕。炎性因子TNF-α異常表達可通過一氧化氮合酶(NOS)、糖醛還原酶等多個途徑參與免疫炎癥反應〔6〕。本研究結果提示干預病變患者體內炎性因子水平的異常增加，有助于控制病情發展。TLRs為模式識別受體，激活后可經下游信號蛋白MyD88相關信號通路分泌大量炎性因子，引發體內大范圍的免疫炎癥反應〔7〕。TLR4為TLRs介導炎癥反應的主要活性受體，研究者發現，T2DM和并發腎病患者的外周血單核細胞均存在前炎癥特征，表面TLR4表達水平顯著提升〔8〕。臨床研究顯示，TLR4基因多態性與1型DM患者DPN無明顯關聯，與T2DM患者明顯相關〔9〕。動物實驗顯示，TLR4、TLR3在T2DM大鼠模型中的異常表達，可促進炎性因子合成和分泌，參與周圍神經病變進程〔10〕。亦有研究顯示，通過輔酶Q10下調TLR4表達可明顯緩解DM大鼠的DPN變性疼痛〔11〕。

活化的TLR4可經MyD88信號通路促進下游信號蛋白IκB磷酸化，進而誘發核轉錄因子進入細胞核，合成并釋放大量炎性因子〔12〕。目前關于TLR4、MyD88信號通路與DPN關系的研究較少。且LR4、MyD88信號通路與DPN關系的研究多源于動物實驗。本研究結果提示TLR4、MyD88信號通路參與調控的外周免疫反應與DPN患者體內炎癥狀態相關。本研究相關性分析說明血漿IL-1β、IL-6濃度升高在受活化的TLR4誘導合成之外可能還有其他調控途徑，TNF-α在TLR4介導的DPN中作用更明顯。T2DM外周血單核細胞中TLR4表達上調與多種因素明顯相關，相關研究顯示，體內血糖水平及高血糖持續時間可能參與了TLR4異常表達〔13〕。HbA1c可較為準確地反映近3個月的血糖控制水平〔14〕。

陷窩蛋白-1屬于細胞質骨架蛋白，廣泛表達于人內皮細胞、巨噬細胞等，能夠通過與相關受體直接接觸來調控其下游信號傳導，是胞外刺激進入胞內的最初環節，其表達異常與動脈硬化、DM等明顯相關〔15〕。研究者發現，肥胖大鼠脂肪細胞中陷窩蛋白-1表達水平較正常大鼠明顯下降〔16〕；初診的T2DM患者單核細胞中陷窩蛋白-1蛋白和mRNA表達水平明顯低于健康人群，且HbA1c是陷窩蛋白-1表達的獨立影響因素〔17〕。基礎研究發現，陷窩蛋白-1可抑制大鼠單核巨噬細胞活性，下調趨化因子和炎性介質水平，發揮抗炎作用；敲除陷窩蛋白-1基因的大鼠體內免疫系統受損，血清炎癥因子水平增加〔18〕。本研究結果提示陷窩蛋白-1表達下調可能加劇TLR4、MyD88信號通路介導的炎癥反應，提升DPN患者體內炎性因子和趨化因子的分泌量。