淺談高效液相色譜法測定豬肉中磺胺類藥物殘留的注意事項

魏春梅，熊 杰，李春曉

（1.武陟縣畜產品質量安全監測中心，河南 武陟454950；2.攀枝花市動物疫病預防控制中心；3.武陟縣動物衛生監督所）

磺胺類藥物是一種廣譜抗菌藥，臨床上主要用于預防和治療感染性疾病，加之其性質穩定，制造不需糧食做原料、產量大、品種多、價格低、使用簡便、供應充足等優點，在獸醫臨床和畜牧養殖業中作為飼料添加劑或動物疾病治療藥物被廣泛應用。但是磺胺藥物會引起人過敏性反應，且可能有致癌性。隨著社會的發展，磺胺類藥物的不合理使用，其在動物性食品中殘留引起生態環境污染和人類健康危害的潛在威脅已備受關注，成為人類亟待解決的問題之一，而各類檢測方法也隨之應運而生。GB/T29694-2013 中規定了用高效液相色譜法測定動物可食性組織中磺胺類殘留的檢測方法。

高效液相色譜法是在經典液相色譜法和氣相色譜法的基礎上，發展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術。具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快等特點。但在縣級畜產品質量安全日常監測檢測中，常常遇到各種各樣的問題。筆者通過測定豬肉中磺胺二甲基嘧啶，闡述一下高效液相色譜法的注意事項。

1 樣品前處理

樣品的前處理是整個實驗的重中之重，而豬肉中磺胺類藥物殘留的測定較其他試驗前處理更是復雜，所以任何一步都可能導致試驗的失敗。根據筆者做豬肉中磺胺類藥物殘留的測定遇到的問題與大家分享一下幾點：

稱好待測樣品時，要加入乙腈和無水硫酸鈉，因防止結塊，所以要立刻渦旋，這樣避免樣品結塊影響樣品中磺胺類藥物的提取。或者也可以加入乙腈渦旋開后再加入無水硫酸鈉，然后再渦旋。

為了提高樣品中磺胺類藥物的提出率，要兩次加入同等的乙腈在渦旋振蕩器上振蕩提取，所以也要兩次離心。為了第2 次的提取效果，第1 次離心要低，一般3 000～5 000 r/min，這樣可以避免離心率太高樣品不易打散。但第2 次離心率要高，一般在14 000 r/min 以上。

試驗前一定事先檢查分液漏斗、離心管的密封性，防止在實驗過程中漏液，造成試驗回收率太低，出現分析上的誤差，特別是使用分液漏斗，應做到每次使用前都要檢查密封性是否良好。另外收集分液漏斗中的下層液體時，一定要先將上端的玻璃塞擰開，由于壓強的原因，避免生拉硬拽將下端打開，造成分液漏斗的損壞。

在減壓濃縮過程中要注意壓力不要超過0.08 Pa，否則會造成旋蒸液體爆沸。為了在減壓旋蒸過程中更好控制壓力，可以在鏈接真空泵的真空皮管處插上1ml 針頭，也可以根據壓力變化，增減針頭數量。旋蒸結束后，一定要先拔掉真空皮管，再取被旋蒸樣品，而不是直接關掉真空泵，如果直接關掉真空泵，這樣將導致真空泵的水被倒吸到旋蒸樣品中。

整個凈化步驟包括預洗、上樣、淋洗、洗脫四步，需控制堿性氧化鋁SPE柱流速3～4 s/滴，洗脫時可控制在1～2 s/滴，切記洗脫時一定控制速度，否則會導致樣品添加回收率太低，質控不合格。依次進行預洗、上樣、淋洗操作時需在上步液體將近流完時進行，應避免柱床干涸。

用流動相溶解的殘留物溶液應該是澄清的，如果仍渾濁可在雞心瓶里加入正己烷3 ml 渦旋萃取再次脫脂，待分層后取下層液體過濾上機。如果加入正己烷再次脫脂后仍然渾濁，可以把兩個微孔濾膜疊加進行過濾，但要注意因為將兩個微孔濾膜疊加進行過濾樣品，阻力會加大，所以在過濾過程中要把握力度，避免將濾膜沖破或則液體溢出。

2 上機測定

開始操作儀器之前，一定按照順序進行開機，即打開電源開關—打開電腦—打開儀器各個開關—打開各個模塊，待儀器自檢通過穩定后，按順序打開各個模塊。首先鏈接XPG 模塊---逆時針擰松清洗閥（兩圈半）--點“沖洗”（出現一個對話框提示是否將清洗閥打開，如打開選擇忽略）—分別排水—排流動相—排水—排乙腈—排甲醇，擰緊清洗閥。

打開WPS 進行模塊鏈接，分別選擇“灌注注射器”、“清洗緩沖環”、“外部清洗針”各點清洗3遍。

根據試驗要求，檢查是否需要更換色譜柱，如需更換，一定注意流動相流動方向。

如果是新柱，可打開馬達，用100%甲醇以0.2 ml/min流速沖洗10～12 h活化色譜柱（為節省時間可以選擇過夜沖洗）。如果是舊柱，至少用100%甲醇以0.2 ml/min 流速沖洗30 min，再逐步將流速提升到0.5、1.0、1.2 ml/min，并在每個流速下保持20 min，執行完成后降下流速，換上試驗要求的流動相流速平衡系統（在此過程中可以創建儀器方法、處理方法、報告模板、序列等）。打開紫外燈，等燈室溫度穩定后，打開采集基線，待基線平穩后可以檢查待檢樣品，測量結束后記得沖洗流路（與平衡系統時相反，同時關閉紫外燈），最后用100%甲醇保護各個流路。斷開各個模塊的鏈接，關閉軟件，關閉各個模塊開關，關閉電腦，最后關閉電源開關，關機順序不可調換。

3 其他影響因素

3.1 儀器的日常維護

儀器室中一般都會存在一些有毒有害氣體，為了加速有毒氣體的揮發，可以讓排風系統繼續工作，禁忌開窗通風，因為長時間開窗可以產生大量的灰塵，影響儀器的精密度和準確度，并且這種污染是很難糾正的。日常維護方法可以將A、B、C、D四個通道都用100%甲醇沖洗，這樣就可以將管道浸泡在甲醇中，切記檢測器只打開電源，切勿打開紫外燈，因紫外燈壽命有限。維護次數，如果長時間不做試驗，可以春秋冬每月1次，夏季由于濕度大，易損壞儀器，可每2個星期1次。

3.2 實驗器皿的清潔

高效液相色譜儀是一個精密度非常高的儀器，所以試驗過程中使用的器皿一定要保證其清潔度，因為這是取得精確檢測結果的前提條件。

3.3 檢測過程常見的儀器故障及解決辦法

采集基線時，沒有基線出現。應該在軟件的工具欄上打開“監測基線”對話框，再重新選擇所需要的通道即可。

做出的樣品峰沒有保留時間和峰面積，打印試驗報告時會顯示。

標準品出現目的峰，而樣品中沒有出現目標峰，可以通過調整標準品濃度解決，這是因為標準品濃度與待測樣品濃度相差太大造成的。添加標準品的濃度原則，盡量選線性范圍內較低的濃度（也不能太低，太低易與雜峰混淆，不易辨別）。添加標準品的濃度盡量與單點標準品濃度接近或一致，這樣有利于試樣的出峰情況與標準品的出峰情況較一致。

如果標準品較標準實驗操作規程出峰時間提前，可以提高流動相中水的比例，減少流動相中有機相的比例，如果標準品較標準實驗操作規程出峰時間延后，可以降低流動相中水的比例，提高流動相中有機相的比例。

洗針時，審計跟蹤顯示驅動針上有障礙物，可以暫時在建立“儀器方法”時，選擇“Nowash”洗針模式，試驗過后要認真檢查是何原因造成的。

高效液相色譜儀是一個精密度非常高的儀器，每次試驗都會出現不一樣的問題，只有多做多積累多交流經驗才是應對每一次試驗的法寶。