定量檢測血清水通道蛋白4 抗體水平在視神經脊髓炎疾病譜中的臨床意義

陳博

視神經脊髓炎屬于中樞神經系統脫髓鞘疾病之一,是脊髓和視神經相繼受累或同時受累所致。該疾病病理改變的關鍵為壞死空洞、硬化斑、脫髓鞘的形成,同時伴有血管周圍炎性細胞浸潤。Lennon 等［1］的研究使用間接熒光免疫法檢測視神經脊髓炎患者的水通道蛋白4 抗體,之后研究者發現視神經脊髓炎不同于多發性硬化,均屬于中樞神經系統脫髓鞘疾病,稱為視神經脊髓炎疾病譜［2］。就目前的醫療水平,臨床檢測視神經脊髓炎疾病譜患者血清中的水通道蛋白4 抗體的檢測方式多為定性檢測,但檢測較少。基于此,本文探究血清水通道蛋白4 抗體水平定量檢測在視神經脊髓炎疾病譜中的臨床價值和意義,具體研究內容和結論報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015 年7 月～2018 年7 月到本院及中國醫科大學附屬第一醫院就診的70 例中樞神經系統脫髓鞘患者,其中視神經脊髓炎疾病譜患者40 例［復發性視神經炎10 例及復發性長節段橫慣性脊髓炎患者10 例(設為Ⅰ組)、視神經脊髓炎20 例(設為Ⅱ組)］、多發性硬化患者30 例(設為Ⅲ組),另選取同期體檢的30 例健康者設為Ⅳ組。Ⅰ組與Ⅱ組均符合視神經脊髓炎及其疾病譜的臨床診斷標準,男18 例、女22 例；年齡29～65 歲,平均年齡(45.25±8.64)歲；平均病程(2.98±0.39)年；脊髓受損段數4～8 個,平均脊髓受損段數(5.64±0.79)個。Ⅲ組男15 例,女15 例；年齡28～66 歲,平均年齡(45.28±8.47)歲；平均病程(3.01±0.41)年；患者均符合多發性硬化臨床診斷標準。Ⅳ組男17 例,女13 例；年齡27～65 歲,平均年齡(45.41±8.25)歲。四組性別、年齡等一般資料比較,差異無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 方法 血清水通道蛋白4 抗體檢測方法：①試劑與儀器：通過間接熒光免疫沉淀法進行檢測,水通道蛋白4 抗體酶聯免疫試劑盒(武漢華美生物有限公司)、KHB ST-360 酶標儀(上海科華實驗系統有限公司)、微量高速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司,型號：TG16-W)、附加可調節吸頭及微量加樣器、電熱恒溫培養箱、量筒、試管、容量瓶等。②檢測方法：靜脈采血,離心法分離血清,速度為3000 r/min,血清分離后存于-80℃。根據水通道蛋白4 抗體酶聯免疫試劑盒的具體操作步驟進行,為確保精確,需將樣品和標準品設置為雙孔,加樣時需使用微量加樣器,此時注意由同一人完成操作,個標本均配特定吸頭,且需使用同一批試劑,并嚴格控制反應溫度和時間,使用KHB ST-360 酶標儀檢測血清水通道蛋白4 抗體吸光度的［D(λ)］值,將正常狀態下的吸光度平均值+3 倍標準差作為陽性檢出的臨界值。

1.3 觀察指標 比較四組血清水通道蛋白4 抗體陽性檢出率,分析血清水通道蛋白4 抗體熒光值與脊髓受累段數、視神經脊髓炎疾病譜水通道蛋白4 抗體呈陽性患者首次發病 2 年內復發次數的相關性。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差()表示,采用t檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。相關分析采用Pearson 相關性分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組中血清水通道蛋白4 抗體的陽性檢出率分別為65.00%(13/20)、70.00%(14/20)、10.00%(10/30)、0,Ⅰ組、Ⅱ組中的血清水通道蛋白4抗體的陽性檢出率明顯高于Ⅲ組、Ⅳ組,差異有統計學意義(P＜0.05)。血清水通道蛋白4 抗體熒光值與脊髓受累段數呈正相關(r=0.136,P=0.017＜0.05)；視神經脊髓炎疾病譜水通道蛋白4 抗體呈陽性患者首次發病2 年內復發次數與抗體熒光值無相關性(P＞0.05)。有5例水通道蛋白4 抗體呈陽性的患者在接受硫唑嘌呤、強的松、甲強龍沖擊等免疫抑制劑治療1～4 個月后,體內的水通道蛋白4 抗體開始轉變為陰性。

3 討論

視神經脊髓炎是一種中樞神經系統脫髓鞘性疾病,可通過免疫抑制劑治療,且療效可見［3］。目前已有多家神經免疫中心建立了完善的檢測方法用于檢測血清水通道蛋白4 抗體的特異性和敏感性,率先建立了間接熒光免疫沉淀法和CBA 法。CBA 法僅限于在細胞表面的觀察,屬于定性檢測,但是間接熒光免疫沉淀法為定量檢測,主要用于測定水通道蛋白4 抗體滴度［4］。為了研究定量檢測血清水通道蛋白4 抗體水平在視神經脊髓炎疾病譜中的臨床意義,從而進行了本次研究。在本次研究中,主要通過間接熒光免疫沉淀法對視神經脊髓炎患者血清水通道蛋白4 抗體含量進行檢測,分析脊髓受累節段數與血清水通道蛋白4 抗體存在的相關性。

最近幾年,關于水通道蛋白4 抗體致病機制的研究有多種可能結果。例如水通道蛋白4 抗體與水通道蛋白4 胞外區接合,以致于水通道蛋白4 的表達缺失,最終造成腦脊液或者血液屏障的滲透性增強。另外還有水通道蛋白4 抗體的主要成分為免疫球蛋白G1 和水通道蛋白4(四聚體結構)可作為補體激活因子,粒細胞聚集起來后進入腦脊液或者血液屏障,從而發生抗體依賴和補體依賴的細胞毒作用,最終造成星形膠質細胞死亡。還有一種可能結果就是水通道蛋白4 發生內化造成興奮性毒物的累積,此時會破壞髓鞘和少突膠質細胞的完整性。有研究表明［5］,視神經脊髓炎的致病性抗體極有可能就是水通道蛋白4 抗體,從此處推斷病情嚴重程度可能與水通道蛋白4 抗體含量有一定關系。有研究通過CBA 法進行檢測發現水通道蛋白4 抗體的滴度水平越高,患者失明的可能性越大,經磁共振成像檢測發現患者脊髓受累段數越多［6］。有研究用間接熒光免疫沉淀法定量檢測血清水通道蛋白4抗體含量,對50 例視神經脊髓炎疾病譜患者(其水通道蛋白4 抗體檢測呈陽性)進行研究,發現病情嚴重患者以及預后情況較差的患者與病情較輕且預后較好的患者比較的結果顯示水通道蛋白4 抗體含量無明顯差異［7］。兩種檢測方法檢測的結果不一致極有可能與采血時機以及樣本采量有關,影響檢測結果的準確性。

目前檢測水通道蛋白4 抗體的方法多種多樣,使用較多的有間接熒光免疫沉淀法、放射免疫沉淀法、CBA 法、流式細胞分析法以及酶聯免疫吸附法。其中間接熒光免疫沉淀法的檢測原理為人胚腎293 細胞被綠色熒光蛋白標記的水通道蛋白4 的cDNA 質粒轉染,待細胞裂解后產生綠色熒光蛋白標記的水通道蛋白4游離蛋白,之后該抗原將其與未標記的水通道蛋白4抗體血清結合合成抗原抗體復合物,最終沉淀,此時借助熒光讀板機測量其熒光值。水通道蛋白4 抗體滴度與熒光值直線相關,能準確的反映水通道蛋白4 抗體的含量。而CBA 檢測水通道蛋白4 M23cDNA 質粒轉染人胚腎293 細胞,此時細胞表面的已經完成表達過程的水通道蛋白4 抗原與血清抗體結合,在熒光顯微鏡下觀察結合成功的抗原抗體復合物。研究顯示［8］,CBA 法檢測水通道蛋白4 抗體的特異性和敏感性較高,但是該檢測方法并不適用于大批量檢測,不能實現定量檢測,而間接熒光免疫沉淀法檢測彌補了這一缺陷,使用此方法可定量檢測水通道蛋白4 抗體,并分析病情程度與抗體水平的相關性。

綜上所述,血清水通道蛋白4 抗體水平能夠幫助鑒別視神經脊髓炎疾病譜和多發性硬化,提高疾病的診斷準確性。