中藥誘導骨髓間充質干細胞成脂分化的研究進展※

藥曉雨 任艷玲

(遼寧中醫藥大學研究生院2019級碩士研究生，遼寧 沈陽 110847)

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種累及多臟腑，并在多種因素長期、共同作用下，以骨代謝異常、骨量低下、骨結構損壞、骨強度受損為特征的慢性全身代謝性疾病。中醫傳統文獻中無OP病名，根據主要癥狀將其歸為骨痿、骨枯、骨極、骨痹、腰痛等范疇。隨著人口老齡化日趨嚴重，我國50歲以上OP導致的骨折率為19.2%，且隨年齡增加其發生率上升[1]。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是來源于中胚層的具有多向分化潛能的干細胞，與OP關系最為密切的是其分化為成骨細胞和成脂細胞，并且BMSCs成骨分化和成脂分化在正常機體中處于“消長平衡”。這種“消長平衡”的打破與OP關系密切，即BMSCs分化失衡，成骨細胞減少，成脂細胞增加。茲將中藥抑制BMSCs成脂分化的研究進展綜述如下。

1 BMSCs成脂分化與OP的關系

OP是一類骨量降低、骨結構破壞、骨強度受損且易發生骨折的全身性疾病，以原發性骨質疏松癥(primary osteoporosis，POP)多見。POP又分為老年性骨質疏松癥(senile osteoporosis，SOP)和絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)。PMOP的發病與脂代謝密切相關，與脂代謝相關的臨床指標是總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。王筱菁等[2]研究表明，絕經后女性的TC、TG、LDL-C均明顯升高。因此，絕經后女性血脂含量增加進而BMSCs成脂分化增多。張添昊[3]研究發現，脂肪的代謝障礙會導致骨髓微循環障礙，使骨代謝能力下降和骨量丟失。脂肪酸能促使成骨細胞轉化為成脂細胞，同時調節BMSCs分化的轉錄因子和信號傳導方式。SOP是由于進入老年，機體BMSCs向成骨分化受到抑制且成骨分裂增殖變緩，成骨效率下降，同時成脂分化成熟且骨吸收活性相對活躍，導致OP的發生。因此，在正常機體狀態下成骨分化和成脂分化處于平衡，機體健康。若受內分泌、年齡等因素影響則BMSCs成脂分化能力增加，成骨能力逐漸減弱，導致骨髓內細胞分化異常，骨代謝異常，出現OP。

2 BMSCs成脂分化的形成機制

首先，BMSCs成脂分化的誘導是細胞P3代完全匯合后加入含有一定濃度的3-異丁基-1甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛、地塞米松、胎牛血清等制成誘導液，進行BMSCs成脂誘導[4]。可通過顯微鏡和油紅O脂肪染色觀察脂滴形態及分化程度。徐道華[5]研究表明，正常胎牛血清體積分數在0.05和0.1時，成脂分化結果較好。但當胎牛血清體積分數增加到0.2時對BMSCs成脂分化具有抑制作用。其次，BMSCs成脂分化與信號通路息息相關。如Wnt信號通路、轉化生長因子β1(TGF-β1)信號通路。其中Wnt信號通路是一個蛋白質作用網絡，參與許多生物過程。此外，Wnt信號通路可增強成骨分化，抑制成脂分化[6]。Shuai Yi等[7]研究發現，微小RNA(miR)參與調節了BMSCs異常的成脂分化，其中miR-199a-3p通過Wnt信號通路調節脂肪形成；miR-199a-3p可通過降低賴氨酸去甲基化酶6A(KDM6A)基因表達，以減少miR-199a-3p激活過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(PPAR-γ)和脂肪酸結合蛋白(ap2)基因，進而抑制BMSCs成脂分化。周鑫等[8]研究表明，Wnt信號通路在CD31-/CD34+/CD146+的脂肪細胞有較強活性，因此CD31-/CD34+/CD146+成脂能力弱，成骨能力強。李清江[9]研究表明，Wnt10b是Wnt信號通路的組成因子之一。Wnt10b基因高表達能對人BMSCs成骨分化起促進作用、成脂分化起抑制作用。在經典的Wnt信號通路中，過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPAR)是其中的轉錄因子，PPAR中的PPAR-γ是該家族的亞型之一，控制許多細胞的代謝過程。有研究認為，PPAR-γ是BMSCs分化中脂肪細胞的“催化劑”，而對于成骨細胞則是“抑制劑”，在經典的Wnt信號通路中通過抑制PPAR-γ因子的表達，進而抑制BMSCs成脂分化[10-11]。葛心慈等[12]實驗表明，在治療OP時藥物干預的各組大鼠對BMSCs中PPAR-γ mRNA下調表達明顯。轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路在成熟機體和發育中的胚胎都參與了許多細胞過程，包括細胞生長、分化、凋亡。其中TGF-β家族包括3個亞型，分別是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。何麗娟等[13]實驗表明，大鼠BMSCs中的TGF-β1的陽性表達位于其細胞質中，且實驗用藥組均可增加BMSCs中TGF-β1蛋白表達，因此TGF-β1在BMSCs成骨分化和成脂分化中均有作用。周鑫[8]研究表明，TGF-β1家族中的骨形成蛋白與胰島素相互作用，有利于BMSCs的成脂分化。

3 中藥對BMSCs成脂分化的影響

OP與BMSCs的成脂分化關系密切，中藥對BMSCs成脂分化影響較多，進而中藥能夠治療OP。對于OP的治療，歷代醫家在古醫籍中多有描述。《內經》記載“骨痿者，補腎法治之”，李東垣《脾胃論》云“真氣又名元氣，乃身生之精氣也，非胃氣不能滋之”。治療OP應重在補腎健脾，益氣活血。

3.1 單味藥或單體對BMSCs成脂分化的影響 目前單味中藥或單體干預BMSCs成脂分化主要有：淫羊藿、補骨脂、石斛、骨碎補、葛根、杜仲、土鱉蟲、丹參、銀杏葉、紅花、萊菔子、姜黃、黃芪、佩蘭、白術等。劉海全等[14]取SD大鼠雙側股骨中BMSCs后，利用貼壁培養法純化細胞，加入淫羊藿含藥血清，隨機將其分為低、中、高劑量組，分別為臨床劑量的5、10、20倍進行成脂誘導分化。結果：與未加淫羊藿含藥血清的成脂誘導組比較，加入淫羊藿含藥血清低、中、高劑量組對抑制PPAR-γ mRNA表達明顯，從而起到抑制BMSCs成脂分化的作用。李智奎等[15]通過淫羊藿提取物淫羊藿苷進行體外培養BMSCs，將淫羊藿苷分為10、20、30、40、50 ng/mL不同濃度，觀察淫羊藿苷對BMSCs的影響。結果：3、4 d時50 ng/mL的淫羊藿苷抑制BMSCs增殖,并且對BMSCs成脂分化的重要基因PPAR-γ、降脂蛋白降脂素(Adipsin)、重組人脂肪酸結合蛋白4(FABP4)均有影響；淫羊藿苷濃度10 ng/mL時PPAR-γ、Adipsin、FABP4表達最低。因此，淫羊藿在一定用量下對BMSCs成脂分化有抑制作用。張洪躍等[16]研究表明，首先通過全骨髓貼壁法進行傳代、培養，后進行誘導成脂分化。將濃度分為0～20 μmol/L梯式增加的5組。油紅O脂肪染色發現，與空白組比較，在補骨脂素誘導下的BMSCs成脂分化各組油紅O脂肪染色陽性對照率均降低，且隨著濃度的增加陽性對照率逐漸降低。異補骨脂素是補骨脂素的同源異構體，有學者研究發現異補骨脂素也具有抑制BMSCs成脂分化的作用。王劍[17]通過油紅O脂肪染色實驗發現，異補骨脂素加藥處理的成脂誘導7 d后，觀察脂肪包漿中所含脂滴含量下降；通過蛋白印跡(Western Blot)實驗發現，成脂分化的關鍵轉錄因子PPAR-γ在小鼠BMSCs中的表達顯著降低，且在濃度為20 μmol/L表達最明顯。徐路加[18]對P3代BMSCs成脂誘導加入石斛多糖進行干預，油紅O脂肪染色結果表明：10、20 d后，石斛多糖濃度在400、800 μg/mL時，被染脂滴數明顯減少。李琰等[19]以骨碎補水煎液灌服去卵巢骨質疏松SD大鼠，給藥12周后對其BMSCs進行成脂誘導16 d后觀察脂滴形態，發現灌服骨碎補水煎液組脂滴數少，體積小；另外，取P3代BMSCs應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)法檢測PPAR-γ、脂蛋白脂肪酶(LPL)mRNA表達，發現骨碎補水煎液組PPAR-γ mRNA、LPL mRNA表達降低。因此，骨碎補水煎液能激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制PPAR-γ mRNA、LPL mRNA的表達，抑制BMSCs成脂分化。齊振熙等[20]用葛根素干預BMSCs 6 d，用實時熒光定量PCR法檢測Wnt/β-catenin信號通路主要成員Wnt10b mRNA、GSK3β mRNA、β-catenin mRNA的表達，發現葛根素各劑量組干預下Wnt10b mRNA、GSK3β mRNA、β-catenin mRNA的蛋白表達上升。在低倍鏡下觀察BMSCs各組圖像，葛根素各劑量組僅含有小脂滴細胞。因此，葛根素能抑制BMSCs成脂分化。張賢等[21]通過杜仲水提物及杜仲醇提物干預誘導BMSCs成脂分化15 d后，應用實時熒光定量PCR法測定PPAR-γ和ap2的表達，發現杜仲水提物和杜仲醇提物的ap2基因表達下調，PPAR-γ基因表達正常。因此，杜仲有利于抑制BMSCs成脂分化，且抑制點作用在ap2基因上。齊振熙等[22]通過在激素誘導后的BMSCs成脂細胞內加入土鱉蟲含藥血清干預6 d后，檢測PPAR-γ和ap2基因表達結果，發現加入土鱉蟲含藥血清組的PPAR-γ和ap2基因表達顯著下調。中藥單體丹酚酸B是丹參的水溶性成分之一，丹參素是丹參的提取物。龐婷婷等[23]應用丹參素和丹酚酸B干預BMSCs成脂分化9 d后，油紅O脂肪染色低倍鏡下觀察，可見丹參素組和丹酚酸B組的脂肪細胞明顯減少。因此，丹參提取物能抑制BMSCs成脂分化，且Cui Liao等[24]研究發現在Wnt信號通路下丹酚酸能抑制BMSCs成脂分化。谷旭[25]將不同濃度的銀杏葉提取物加入純化后的P3代BMSCs中誘導成脂分化7 d，結果顯示：細胞表面抗原CD44、CD105為陽性，CD34為陰性；油紅O脂肪染色可見不同濃度銀杏葉提取物組脂滴均減少，且隨著銀杏葉提取物濃度增加，脂滴數量減少；實時熒光定量PCR檢測顯示ap2和PPAR-γ基因表達隨著濃度增加逐步降低。于濤[26]通過提取紅花中有效成分羥基紅花黃色素A，將其分為不同濃度加入BMSCs干預成脂誘導6 d，結果發現低倍鏡下油紅O脂肪染色不同濃度紅花提取物脂滴均有減少；PCR檢測PPAR-γ mRNA表達明顯降低。萊菔子有效提取物為芥子堿。黃煒平等[27]通過低濃度過氧化氫(H2O2)誘導BMSCs成脂分化并加入芥子堿進行干預，通過Western Blot和實時熒光定量PCR法檢測PPAR-γ、ap2及葡萄糖轉運蛋白(Glut4)蛋白表達及基因表達，發現PPAR-γ、ap2及Glut4蛋白表達及基因表達均下降。姜黃素為姜黃的提取物。張慶美等[28]將不同濃度姜黃素加入P5代豬BMSCs中進行成脂誘導10 d，油紅O脂肪染色可見隨著姜黃素濃度的增加細胞成脂率逐漸下降；實時熒光定量PCR檢測PPAR-γ2基因隨濃度增加表達降低。黃芪多糖是黃芪的提取物之一。魏孔熙等[29]運用X線輻射法干預誘導人BMSCs向脂肪細胞轉化，并加入黃芪多糖50 μg/mL后通過油紅O脂肪染色和Western Blot檢測進行比較。結果：油紅O脂肪染色后，加入黃芪多糖的BMSCs細胞結構稍增加、細胞形態稍正常、成脂分化能力稍增強。Western Blot檢測加入黃芪多糖的BMSCs細胞PPAR-γ的表達增強。伍志偉等[30]通過低、中、高不同濃度低氧環境下誘導BMSCs向脂肪細胞分化，并加入低、中、高不同劑量的黃芪多糖進行干預。通過實時熒光定量PCR和Western Blot檢測細胞中PPAR-γ、LPL基因及蛋白表達。結果：與單純低氧環境下的細胞比較，加入不同劑量黃芪多糖的PPAR-γ、LPL的基因蛋白表達均顯著增加。故黃芪提取物黃芪多糖對受X線輻射條件下和低氧環境下的BMSCs成脂分化有促進作用。張潔[31]將佩蘭水煎液分為低、中、高不同劑量組后灌胃高脂飲食的SD大鼠7 d，取BMSCs培養。結果：低、中、高劑量組含藥血清在油紅O脂肪染色實驗中脂滴形態均處于抑制狀態。白術內酯Ⅲ是白術單體之一。李可[32]通過H2O2和不同濃度的白術內酯Ⅲ分別干預誘導BMSCs成脂分化。結果：白術內酯Ⅲ誘導的BMSCs在油紅O脂肪染色下脂滴數量和形態明顯下降，實時熒光定量PCR和Western Blot檢測的PPAR-γ基因和蛋白表達顯著下降。

3.2 中藥復方對BMSCs成脂分化的影響 楊鋒等[33]通過右歸丸灌胃大鼠3 d后取其血清，進行BMSCs成脂誘導分化，通過實時熒光定量PCR法和甲基化特異性PCR法檢測，發現右歸丸含藥血清能通過去甲基化的方式抑制BMSCs成脂分化，其與BMSCs成脂分化相關的轉錄因子PPAR-γ基因也明顯下調。李樹強等[34]通過桃紅四物湯低、中、高劑量干預含激素的BMSCs成脂分化6 d，發現桃紅四物湯不同劑量組隨著藥物劑量增加，細胞內PPAR-γ、ap2表達顯著下調，因此桃紅四物湯能抑制BMSCs成脂分化。王芳等[35]將黃芪散(藥物組成：葛根、黃芪、桑白皮)含藥血清分為5%、10%、20%濃度組干預大鼠BMSCs，通過檢測成脂基因ap2 mRNA樣本的濃度及純度，發現ap2 mRNA在5%濃度時表達最明顯。因此，黃芪散對BMSCs成脂分化有一定的抑制作用。李遠棟等[36]證明榮筋片(藥物組成：牛膝、蒺藜、陳皮、杜仲、茯苓、甘草)能抑制骨組織中PPAR-γ表達，對BMSCs成脂分化具有抑制作用。劉幸明等[37]選擇金匱腎氣丸(藥物組成：地黃、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、澤瀉、桂枝、制附子、牛膝、炙車前子)、健骨二仙丸(藥物組成：龜版、鹿角膠、黨參、枸杞子、續斷、山藥)、六味地黃丸(藥物組成：熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉)對老化的BMSCs進行干預，實驗通過氧化誘導衰老模型后，分為模型組、金匱腎氣丸組、健骨二仙丸組和六味地黃丸組。結果：與模型組比較，3個治療組均可下調與成脂分化密切相關的PPAY-γ2、C/增強子結合蛋白β(EBPβ)mRNA，其中金匱腎氣丸對PPAR-γ2下調作用優于健骨二仙丸和六味地黃丸，六味地黃丸對C/EBPβ下調作用優于金匱腎氣丸和健骨二仙丸。周亞娜等[38]通過補腎化痰方(藥物組成：淫羊藿、補骨脂、瓜蔞、神曲、山楂)成脂誘導15 d，油紅O脂肪染色結果發現化痰方(藥物組成：瓜蔞、神曲、山楂)脂肪細胞數量減少，LPL mRNA的表達下調明顯，因此化痰方能更好地抑制BMSCs成脂分化。徐無忌等[39]對BMSCs成脂誘導后加入骨康方(藥物組成：丹參、補骨脂、淫羊藿)含藥血清，發現加入骨康方的脂肪細胞轉化率明顯降低。李曉敏等[40]將健脾活骨方(藥物組成：白術、黨參、赤芍、桂枝、法半夏、茯苓、熟地黃、當歸、甘草、川芎)進行不同的萃取方式，得到乙酸乙酯、正丁醇、水等萃取部位，并觀察不同萃取部位對BMSCs成脂分化的影響。其中油紅O脂肪染色后發現隨著乙酸乙酯部位濃度的增加，紅色脂滴數量逐漸減少。張志峰等[41]在誘導老年性大鼠BMSCs成脂分化中加入壯骨強筋片(藥物組成：杜仲、淫羊藿、牛膝、鹿角膠、肉蓯蓉、何首烏、龜版、當歸、地骨皮、獨活、羌活)含藥血清14 d，發現加入壯骨強筋片含藥血清組PPAR-γ和LPL基因表達降低，說明壯骨強筋片對BMSCs成脂分化有抑制作用。

4 結 語

綜上所述，BMSCs成骨分化與成脂分化的動態平衡是維持機體骨骼系統穩定的關鍵，并且促進成骨分化、抑制成脂分化是治療OP的新靶點。Wnt信號通路和TGF-β信號通路是OP發病機制和BMSCs成脂分化的重要信號通路，PPAR-γ、C/EBPβ等基因是Wnt和TGF-β信號通路中重要的轉錄因子。大多數學者通過提取中藥中有效成分抑制成脂分化的重要因子，以達到治療OP目的。大部分中藥通過補腎健脾、溫陽益氣活血，調整腎陰腎陽，達到腎氣平和。腎精充盈則精生髓，髓化氣生血，可將現代醫學中的BMSCs與中醫“髓”的概念相呼應。故腎陰陽和合則髓亦充盈，BMSCs的成骨分化和成脂分化也能維持動態平衡。孫思邈《備急千金要方》云“骨極者主腎也，腎應骨，骨與腎合”，骨痹不已，感受邪氣則內舍于腎，腎與骨的關系尤為密切。故補腎陰或補腎陽的淫羊藿、骨碎補、補骨脂及左歸丸、右歸丸、金匱腎氣丸等能促進BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化。髓能化氣生血，腎氣充沛則瘀血去，新血生，腎氣有力推動和化解機體瘀血，故土鱉蟲、丹參、紅花等對BMSCs的分化有一定影響。中藥及其中成藥防治OP，以改善患者癥狀、降低骨折發生風險、提高生活質量為原則，但中藥所含化學成分復雜多樣，提取有效成分的精確度和濃度難以把控，有待今后進一步研究。