青龍衣酚酸類化學成分研究

付起鳳，宋紅娟，朱琳，高蕙蕊，馬丹娜，張曉娟，周媛媛

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

青龍衣是胡桃科胡桃屬植物核桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)未成熟外果皮，主產于東北、河北、山東、山西和陜西等地，本項目研究對象為長白山野生青核桃皮，最具顯著、多樣的藥效價值。其性平，味甘、澀，有毒，具有清熱解毒、止痛止痢、祛風療癬的功效[1]。據文獻報道青龍衣具有良好的抗腫瘤[2]，抗氧化[3]，抗菌等藥理活性，同時對I型糖尿病患者的血糖控制有明顯的效果。為了進一步研究青龍衣抗腫瘤藥效物質基礎，挖掘新的活性成分，本實驗對青龍衣乙酸乙酯部位進行了深入研究，從中共分離得到15個酚酸類化合物。

1 儀器與材料

NE-1101型旋轉蒸發儀(日本東京理化株式會社)；AV-400型超導核磁共振儀(Bruker公司)；Q-TOF(ESI)高分辨質譜儀(Waters公司)；Sephadex LH-20(Pharmacia公司)；柱色譜硅膠(200～300目)和薄層色譜硅膠(青島海洋化工廠)；515-2414半制備型高效液相色譜(Waters公司)；用于半制備液相的試劑為色譜純；其余均為分析純。

青龍衣藥材于2017年7月采自吉林省長白山地區。經黑龍江中醫藥大學藥學院王振月教授鑒定為胡桃科植物核桃楸(JulansmandshuricaMaxim)未成熟外果皮，標本(20170715)保存于黑龍江中醫藥大學化學教研室。

2 提取與分離

將陰干的青龍衣藥材(10.0 kg)適當粉碎，以8倍量95%乙醇溶液室溫浸泡7 d，收集濾液，上述操作重復3次，減壓濃縮得到浸膏(695.5 g)。浸膏加適量蒸餾水分散后，二氯甲烷、乙酸乙酯及水飽和的正丁醇多次萃取，其中得到乙酸乙酯的萃取部位浸膏(112.6 g)。乙酸乙酯萃取物部分經硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(100∶0～0∶100)梯度洗脫，得到5個流份(Fr. 1～Fr. 5)。Fr. 1經硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇(50∶1～15∶1)梯度洗脫，然后重結晶，分離得到14(14.4 mg)和15(7.4 mg)。Fr. 3經過硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(30∶1～1∶1)梯度洗脫，結合Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)，分離得到化合物13(5.5 mg)、9(6.1 mg)、10(9.7 mg)和12(5.3 mg)。Fr.5經ODS柱色譜，甲醇-水(40∶60→80∶20,V/V)梯度洗脫，半制備液相HPLC(甲醇∶水=30∶70，V/V)分離得到化合物1(5.7 mg)、11(4.4 mg)和2(3.6 mg)；半制備液相HPLC(甲醇∶水=60∶40，V/V)分離得到化合物3(5.6 mg)、4(3.8 mg)、5(3.5 mg)、6(3.3 mg)、7(5.5 mg)和8(4.2 mg)。

3 結構鑒定

化合物1: 無色針晶。HR-ESI-MS m/z: 111 [M+H]+，分子式為C6H6O2。1H-NMR (CD3OD，400 MHz) δ: 6.65 (4H，s，H-2，3，5，6)。13C-NMR (CD3OD，100 MHz) δ: 115.4(C-2，3，5，6)，149.4(C-1，4)。上述數據與文獻[4]報道基本一致，故鑒定為對苯二酚。

化合物2: 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 139 [M+H]+，分子式為C8H10O2。1H-NMR (CD3OD，400 MHz) δ:1.96 (3H，s，7-CH3)，2.14 (3H，s，8-CH3)，6.11 (2H，s，H-4，6)。13C-NMR (CD3OD，100 MHz) δ: 18.4 (C-7)，21.4 (C-8)，108.1 (C-4，6)，109.4 (C-2)，136.7 (C-5)，160.1 (C-1，3)。上述數據與文獻[5]報道基本一致，故鑒定為2，5-二甲基間苯二酚。

化合物3: 白色針晶。HR-ESI-MS m/z: 181 [M+H]+，分子式為C9H8O4。1H-NMR (CD3OD，400 MHz) δ: 6.20 (1H，d，J = 15.8 Hz，H-8)，6.78 (1H，d，J = 8.0 Hz，H-5)，6.87 (1H，dd，J = 8.0，1.7 Hz，H-6)，7.05 (1H，d，J = 1.7 Hz，H-2)，7.47 (1H，d，J = 15.8 Hz，H-7)。13C-NMR(CD3OD，100 MHz) δ: 115.0 (C-2)，116.8 (C-5)，117.0 (C-7)，122.5 (C-6)，128.4 (C-1)，145.7 (C-4)，146.6 (C-8)，149.4 (C-3)，172.3 (C-9)。上述數據與文獻[6]報道基本一致，故鑒定為咖啡酸。

化合物4: 無色針晶。HR-ESI-MS m/z: 169 [M+H]+，分子式為C8H8O4。1H-NMR (CD3OD，400 MHz) δ: 3.83 (3H，s，3-OCH3)，6.81 (1H，d，J=8.6 Hz，H-5)，7.56 (1H，d，J =8.6 Hz，H-6)，7.59 (1H，brs，H-2)。13C-NMR (CD3OD，100 MHz) δ: 56.2 (-OCH3)，113.4 (C-2)，115.6 (C-5)，123.3 (C-1)，125.1 (C-6)，148.3 (C-4)，152.7 (C-3)，170.1 (C=O)。上述數據與文獻[7]報道基本一致，故鑒定為香草酸。

化合物5: 白色針晶。HR-ESI-MS m/z: 199 [M+H]+，分子式為C9H10O5。1H-NMR (CD3OD，400 MHz) δ: 3.82 (6H，s，3，5-OCH3)，7.25 (2H，s，H-2，6)。13C-NMR (CD3OD，100 MHz) δ: 55.7 (3，5-OCH3)，107.2 (C-2，6)，120.4 (C-1)，140.1 (C-4)， 147.7 (C-3，5)，168.2 (-COOH)。上述數據與文獻[7]報道基本一致，故鑒定為丁香酸。

化合物6: 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 155 [M+H]+，分子式為C7H6O4。1H-NMR (DMSO-d6，400 MHz) δ: 6.79 (1H，d，J = 8.2 Hz，H-5)，7.31 (1H，dd，J = 1.6，8.2 Hz，H-6)，7.34 (1H，d，J = 1.6 Hz，H-2)，9.28(1H，s，3-OH)，9.70 (2H，s，4-OH)，12.26 (1H，s，-COOH)。13C-NMR (DMSO-d6，100 MHz) δ: 116.4(C-5)，116.9 (C-2)，122.5 (C-1)，122.9 (C-6)，146.0 (C-3)，151.4 (C-4)，168.7 (C-7)。上述數據與文獻[8]報道基本一致，故鑒定為原兒茶酸。

化合物7: 白色至透明針晶。HR-ESI-MS m/z: 137 [M-H]-，分子式為C7H6O3。1H-NMR (CD3OD，400 MHz) δ: 6.79 (2H，d，J = 8.2 Hz，H-3，5)，7.92 (2H，d，J = 8.2 Hz，H-2，6)。13C-NMR (CD3OD，100 MHz) δ: 116.4 (C-3，5)，123.3 (C-1)，129.6 (C-2，6)，163.2 (C-4)，170.4 (C-7)。上述數據與文獻[9]報道基本一致，故鑒定為對羥基苯甲酸。

化合物8: 無色片狀結晶。HR-ESI-MS m/z: 197 [M+H]+，分子式為C10H12O4。1H-NMR (DMSO-d6，400 MHz) δ: 1.95 (3H，s，3-CH3)，2.35 (3H，s， 6-CH3)，3.88 (3H，s，4-OCH3)，6.26 (1H，s，H-5)，10.13 (1H，s，2-OH)，11.67 (1H，s，-COOH)。13C-NMR (DMSO-d6，100 MHz) δ: 8.8 (C-3)，23.6 (C-6)，52.1 (-OCH3)，104.3 (C-1)，108.1 (C-3)，110.7 (C-5)，138.6 (C-6)，160.3 (C-2)，162.0 (C-4)，171.9 (-COOH)。上述數據與文獻[5]報道基本一致，鑒定為2-羥基-4-甲氧基-3，6-二甲基苯甲酸。

化合物9: 無色粉末。HR-ESI-MS m/z: 339 [M+H]+，分子式為C16H18O8。1H-NMR (DMSO-d6，400 MHz) δ: 1.79 (1H，dd，J = 13.4，7.3 Hz，H-6′a)，1.95 (3H，m，H-2′，6′b)，3.59 (1H，m，H-4′)，3.89 (1H，m，H-5′)，4.84 (1′-OH)，4.91 (4′-OH)，5.14 (1H，m，H-3′)，6.28 (1H，d，J = 16.2 Hz，H-β)，6.77 (2H，d，J = 8.7 Hz，H-3，5)，7.51 (1H，d，J = 16.2 Hz，H-α)，7.54 (2H，d，J = 8.7 Hz，H-2，6)，10.02 (Ar-OH)。13C-NMR (DMSO-d6，100 MHz) δ: 35.9 (C-2′)，38.4 (C-6′)，67.6 (C-4′)，70.9 (C-3′)，71.1 (C-5′)，73.9 (C-1′)，114.9 (C-β)，115.8 (C-3，5)，125.4 (C-1)，130.6 (C-2，6)，144.6 (C-α)，159.6 (C-4)，166.1 (-C=O)，175.2 (-COOH)。上述數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定為3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid。

化合物10: 無色粉末。HR-ESI-MS m/z: 339 [M+H]+，分子式為C16H18O8。1H-NMR (DMSO-d6，400 MHz) δ: 1.80 (1H，dd，J = 13.4，7.3 Hz，H-6′a)，1.99 (3H，m，H-2′，6′b，3.60 (1H，m，H-4′)，3.81 (1H，m，H-3′)，4.82 (1′-OH)，4.96 (4′-OH)，5.18 (1H，m，H-5′)，5.45(1H，s，3′-OH)，6.33 (1H，d，J = 16.2 Hz，H-β)，6.79 (2H，d，J = 8.7 Hz，H-3，5)，7.51 (1H，d，J=16.2 Hz，H-α)，7.54 (2H，d，J = 8.7 Hz，H-2，6)，10.02 (Ar-OH)。13C-NMR (DMSO-d6，100 MHz) δ: 35.2 (C-2′)，38.5 (C-6′)，68.3 (C-4′)，70.8 (C-3′)，71.2 (C-5′)，73.6 (C-1′)，115.2 (C-β)，115.9 (C-3，5)，125.4 (C-1)，130.4 (C-2，6)，144.6 (C-α)，159.8 (C-4)，166.3 (-C=O)，174.9 (-COOH)。上述數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定為5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid。

化合物11: 黃色針晶。HR-ESI-MS m/z: 373 [M+H]+，分子式為C18H12O9。1H-NMR (DMSO-d6，400 MHz) δ: 4.05 (6H，s，-OCH3)，7.43 (1H，d，J = 2.0 Hz ，H-2)，7.55 (2H，s，H-5，5′)，10.74 (2H，s，-OH)。13C-NMR (DMSO-d6，100 MHz) δ: 60.7 (2×OCH3)，111.2 (C-5，5′)，109.3 (C-1，1′)，111.9 (C-6，6′)，138.5 (C-3，3′)，140.3 (C-2，2′)，150.7 (C-4，4′)，160.5 (C-7，7′)。上述數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定為3，3′-二甲氧基鞣花酸。

化合物12: 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 325 [M+H]+，分子式為C15H16O8。1H-NMR (DMSO-d6，400 MHz) δ: 3.87 (6H，s，2×OCH3)，5.70 (1H，s，H-2)，6.44 (1H，d，J = 16.0 Hz，H-α)，6.97 (1H，d，J = 8.0 Hz，H-5′)，7.09 (1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′)，7.14 (1H，d，J = 1.6 Hz，H-2′)，7.65 (1H，d，J = 16.0 Hz，H-β)。13C-NMR (DMSO-d6，100 MHz) δ: 53.7 (2-OCH3)，56.5 (-OCH3)，73.4 (C-2)，112.1 (C-5′)，114.5 (C-α)，115.0 (C-2′)，123.4 (C-6′)，128.2 (C-1′)，148.1 (C-4′)，148.7 (C-β)，152.2 (C-3′)，167.3 (C-1)，166.9 (C-3)，167.3 (-C=O)。上述數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定為阿魏酰乳酸二甲酯。

化合物13: 白色針晶。HR-ESI-MS m/z: 199 [M+H]+，分子式為C9H10O5。1H-NMR (CD3OD，400 MHz)δ: 1.36 (3H，t，J=8.0 Hz，H-9)，4.25 (2H，q，J=8.0 Hz，H-8)，7.06 (2H，s，H-2，6)。13C-NMR (CD3OD，100 MHz) δ: 14.4 (C-9)，61.5 (C-8)，110.4 (C-2，6)，121.6 (C-1)，139.9 (C-4)，146.9 (C-3，5)，168.6 (C-7)。上述數據與文獻[13]報道基本一致，故鑒定為沒食子酸乙酯。

化合物14: 淡黃色油狀。HR-ESI-MS m/z: 255 [M+H]+，分子式為C17H18O2。1H-NMR (CDCl3，400 MHz) δ: 2.79 (1H，m，H-2)，2.92 (1H，m，H-5)，3.10 (1H，m，H-4)，3.13 (1H，m，H-2)，4.33 (1H，m，H-3)，7.22 (1H，m，H-9)，7.24 (2H，m，H-7，11)，7.31 (2H，m，H-8，10)，7.46 (2H，m，H-3′，5′)，7.57 (1H，m，H-4′)，7.93 (2H，d，J = 7.5 Hz，H-2′，7′)。13C-NMR (CDCl3，100 MHz) δ: 31.2 (C-4)，32.5 (C-5)，45.7 (C-2)，67.1 (C-3)，125.8 (C-9)，128.2 (C-7，11)，128.4 (C-2′，6′)，128.7 (C-8，10)，128.9 (C-3′，5′)，133.3(C-4′)，135.5 (C-1′)，141.7 (C-6)，200.6 (C-1)。上述數據與文獻[14]報道基本一致，故鑒定為(S) -3-羥基-1，5-二苯基-1-戊酮。

化合物15: 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 529 [M+H]+，分子式為C35H60O3。1H-NMR (C5D5N，400 MHz) δ: 0.87 (3H，t，J = 6.2 Hz，H-26)，1.22～1.34 (44H，m，H-4～25)，1.70 (2H，m，H-3)，2.44 (2H，t，J = 7.2 Hz，H-2)，5.13 (2H，d，J = 6.6 Hz，H-9′)，5.88 (1H，m，H-8′)，6.73 (1H，d，J = 11.5 Hz，H-7′)，7.16 (2H，d，J = 8.6 Hz，H-3′，5′)，7.36 (2H，d，J = 8.6 Hz，H-2′，6′)。13C-NMR (C5D5N，100 MHz) δ: 14.2 (C-26)，22.6 (C-25)，24.6～30.5 (C-4～23)，25.6 (C-3)，32.2 (C-24)，34.5 (C-2)，116.5 (C-3′，5′)，124.1 (C-8′)，127.5 (C-1′)，130.8 (C-2，6′)，132.7 (C-7′)，158.6 (C-4′)，173.3 (C-1)。上述數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定為Z-P-coumaryl-hexacosanoate。

4 小結

本研究采用反復硅膠柱色譜、Sephadex LH-20、ODS柱色譜和半制備HPLC對青龍衣95%乙醇提取物乙酸乙酯部位進行分離純化，從中得到15個化合物，分別鑒定為對苯二酚(1)、2，5-二甲基間苯二酚(2)、咖啡酸(3)、香草酸(4)、丁香酸(5)、原兒茶酸(6)、對羥基苯甲酸(7)、2-羥基-4-甲氧基-3，6-二甲基苯甲酸(8)、3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid(9)、5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid(10)、3，3′-二甲氧基鞣花酸(11)、阿魏酰乳酸二甲酯(12)、沒食子酸乙酯(13)、(S)-3-羥基-1，5-二苯基-1-戊酮(14)、Z-P-coumaryl-hexacosanoate(15)。其中化合物8～15為首次從該植物中分離得到。