類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物成分分析及其抗菌活性研究

朱丹丹，張午寅，程偉，劉瑩，呂春艷

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省預(yù)防與治療老年性疾病藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076)

類葉牡丹(CaulophyllumrobustumMaxim.)為小檗科紅毛七屬植物，多年生草本。黑龍江、吉林、遼寧等東北亞區(qū)均有分布，野生資源以黑龍江省最為豐富，并可以人工栽培[1]。據(jù)民間驗(yàn)方記載，類葉牡丹對類風(fēng)濕、胃痛及婦科疾病等均有較好的療效[2]。國外將其同屬植物蘭籽類葉牡丹(CaulophyllumthalictroidesMaxim.)用于治療腹痛、腹瀉、胃痛及婦科分娩疼痛，并在北美曾經(jīng)作為保健品服用,該植物含有的小極性脂溶性化合物具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，這與類葉牡丹在中國民間傳統(tǒng)用藥的臨床實(shí)踐是一致的。黑龍江類葉牡丹果實(shí)為漿果，其小極性脂溶性成分有其生源特征,因此筆者將類葉牡丹果實(shí)采用超臨界-CO2(SFE-CO2)提取其脂溶性成分，得到棕黃色油狀脂溶性提取物，再借助氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對其化學(xué)成分進(jìn)行了分析。利用微量二倍連續(xù)梯度稀釋法測定提取物的最小抑菌濃度(MIC),平板轉(zhuǎn)種法測定其最小殺菌濃度(MBC)。

1 儀器及試劑

類葉牡丹果實(shí)樣品采自黑龍江省綏棱林業(yè)局，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為CaulophyllumrobustumMaxim fruit，即類葉牡丹果實(shí)。

SFT-110XW型超臨界CO2流體萃取儀(賽普泰克有限公司,中國)。GC-MS聯(lián)用色譜儀采用Aglient6890/5973型GC-MS-DS聯(lián)用儀(安捷倫科技有限公司，美國)。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 提取

將干燥的類葉牡丹果實(shí)200 g碾碎，投入容量1 kg的萃取釜中, 萃取壓力設(shè)定為40 MPa，二氧化碳流速為10 kg/h連續(xù)萃取2 h，收集萃取液，得到棕黃色油狀物，即類葉牡丹果實(shí)脂溶性成分，產(chǎn)率為1.86%(w/w)。

2.2 GC-MS分析

氣相色譜條件：SE-54石英毛細(xì)管柱，0.25 mm×30 m;柱前壓8 psi,柱溫60～280 ℃，程序升溫5 ℃/min；進(jìn)樣口溫度：300 ℃，分流比：60,氣化室溫度：280 ℃；載氣為高純氦，流速1 mL/min;進(jìn)樣量1.0 μL。

質(zhì)譜及分析條件： EI離子源, 電子能量:70 eV,掃描速度:1 amu/sec,掃描幅度:12～500 amu,離子溫度:230 ℃,標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫NIST。

應(yīng)用GC-MS中的DS數(shù)據(jù)系統(tǒng)對類葉牡丹經(jīng)超臨界提取的脂溶性成分進(jìn)行分析，檢索結(jié)果結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)并與DS處理系統(tǒng)提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫進(jìn)行核對，人工解析鑒定圖譜，確定脂溶性成分的化學(xué)組成。色譜峰由DS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理，同時(shí)根據(jù)峰面積歸一法進(jìn)行相對含量分析。

2.3 抗菌實(shí)驗(yàn)

抗菌實(shí)驗(yàn)菌株為金黃葡萄球菌、傷寒沙門氏菌等共4種。

實(shí)驗(yàn)菌液配置:MH肉湯用于接種細(xì)菌，置普通培養(yǎng)箱(37 ℃，24 h)培養(yǎng)，比濁法計(jì)數(shù)。培養(yǎng)液被調(diào)配成106CFU/mL，使用肉湯培養(yǎng)基和普通瓊脂平板培養(yǎng)基，采用微量二倍連續(xù)梯度稀釋法測定MIC，平板轉(zhuǎn)種法測定MBC[3]。

MIC的測定:將類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物溶于含5%Tween 80的肉湯，進(jìn)行二倍連續(xù)梯度稀釋，將各濃度樣品液分別加到96孔培養(yǎng)板，0.15 mL/孔。再依次加入濃度為106CFU/mL的實(shí)驗(yàn)菌液50 μL/孔。同時(shí)設(shè)立對照細(xì)菌孔。在濕盒內(nèi)于普通培養(yǎng)箱(37 ℃，24 h)培養(yǎng)，觀察，無細(xì)菌生長孔的最小藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

MBC的測定:將細(xì)菌未生長孔(≥MIC)的培養(yǎng)物逐個用無菌生理鹽水稀釋20倍，并吸取0.05 mL逐個點(diǎn)種于瓊脂平板，在普通培養(yǎng)箱(37 ℃，24 h)培養(yǎng)，無細(xì)菌生長接種區(qū)域所對應(yīng)的最小藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

陰性對照為空白培養(yǎng)基，0.5 mg/mL慶大霉素為陽性對照。

3 結(jié)果與討論

3.1 超臨界提取物的GC-MS分析

依據(jù)據(jù)類葉牡丹果實(shí)超臨界提取脂溶性成分的GC-MS分析,總離子流圖給出51個峰，經(jīng)過DS處理系統(tǒng)提供的標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫核對與計(jì)算機(jī)檢索，圖譜人工解析，相關(guān)文獻(xiàn)印證，鑒定出40個化合物，占揮發(fā)油總量的94.24%。利用歸一法測定了各物質(zhì)的相對百分含量。所得的總離子圖見圖1，類葉牡丹果實(shí)脂溶性成分檢索分析及相對含量結(jié)果見表1。

表1中結(jié)果顯示，類葉牡丹果實(shí)經(jīng)超臨界-CO2提取的脂溶性成分中脂肪酸酯類占40.4%,其中甲酸異戊酯(isopentyl formate)相對含量最高, 達(dá)到了23.536%，脂肪酸類化合物占35.570%，烷烴占2.962%,脂肪醇占比較小，尚含醚、酮類、烯烴類、生物堿類和芳香族化合物。經(jīng)分析該脂溶性成分中不但含有已經(jīng)報(bào)道的生物堿N-Methylcytisine，還首次在該植物中發(fā)現(xiàn)了五味子醇甲(Schizandrol)等化合物。

表1 類葉牡丹脂果實(shí)溶性成分的化學(xué)組成及相對含量

圖1超臨界-CO2提取類葉牡丹果實(shí)脂溶性成分總離子流圖

3.2 類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物體外抗菌活性

類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對4種標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC和MBC值如表2所示，從表中結(jié)果可以看出類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對實(shí)驗(yàn)所選取的4種實(shí)驗(yàn)菌株均有抑制和滅活作用。

表2 類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC和MBC值(g/L)

4 小結(jié)

根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道，類葉牡丹果實(shí)脂溶性成分應(yīng)該是含有小極性的生物堿、皂苷、甾醇，甚至還有芳香類成分，但由于本文采用超臨界-CO2提取方法及GC-MS分析方法，可能影響了一些比如小極性皂苷的檢出，但文獻(xiàn)報(bào)道的N-Methylcytisine和胺類化合物均得以進(jìn)行合理的分析檢出，這為該植物通過常規(guī)手段提取分離不便分離鑒定成分的檢識提供了一種選擇[4-8]。

類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對大腸桿菌86953株和金黃色葡萄球菌ATCC25925的MIC值是0.8 g/L和0.12 g/L，表明類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對大腸桿菌86953株和金黃色葡萄球菌ATCC25925株有比較顯著的抑制作用；類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對枯草芽孢桿菌CMCC63501株和傷寒沙門菌54721株的MIC值分別是0.4、0.6 g/L，表明類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對此兩種細(xì)菌也有明顯的抑制作用。類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對大腸桿菌86953株和金黃色葡萄球菌ATCC25925株的MBC值是1.6、0.24 g/L，表明類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對大腸桿菌有滅殺作用，對金黃色葡萄球菌有顯著的殺滅作用；類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對枯草芽孢桿菌CMCC63501株和傷寒沙門菌54 721株的的MBC值分別是0.8、1.2 g/L，表明類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對這兩種細(xì)菌也有明顯的殺滅作用。可見,類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對選用的4種菌株均有殺滅作用,且類葉牡丹果實(shí)超臨界提取物對金黃色葡萄球菌ATCC25925株的抑制及滅活作用比較顯著。