外周血中性粒細胞CD99表達水平與冠心病的相關性研究

林曉曉 高貝貝 黃進宇

冠心病是由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或阻塞導致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病，為動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型[1]，發病率和致死率逐年上升。冠心病通常是由多種危險因素共同或相互作用下發病,而不是任何單一危險因素的極端異常所致，目前國內外研究普遍認為男性、肥胖、吸煙、高血壓、糖尿病和血脂代謝異常等為冠心病的傳統危險因素[2-3]。CD99是一種高度糖基化的32kDa跨膜蛋白，在大多數造血細胞和內皮細胞上表達。有研究表明CD99參與中性粒細胞跨內皮細胞遷移[4-5]。冠心病發生、發展與機體免疫功能密切相關,動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病，白細胞跨內皮細胞遷移參與了動脈粥樣硬化斑塊的發生、發展[6-7]。本研究旨在分析冠心病患者外周血中性粒細胞CD99表達水平與冠心病之間的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2013年7月至2014年7月在杭州市第一人民醫院心內科住院行冠狀動脈造影的患者338例，其中男 219 例，女 119 例，年齡 31～91（65.8±10.7）歲。根據冠狀動脈狹窄程度，分為冠心病組（至少一支冠狀動脈管徑狹窄≥50%）245例和冠狀動脈粥樣硬化組（簡稱硬化組，冠狀動脈狹窄＜50%）93例。冠心病組男167 例，女 78 例，年齡 43～91（67.6±9.8）歲；硬化組男 52例，女 41 例，年齡 31～86（61.1±11.3)歲。兩組患者性別比較差異無統計學意義（P＞0.05），年齡比較差異有統計學意義（P＜0.05）。排除標準：持續性維持性透析、急性嚴重傳染病、腫瘤性疾病、嚴重肝功能障礙、慢性炎癥性疾病。本研究經杭州市第一人民醫院倫理委員會批準，并獲得所有患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集患者的括甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、肌酐（Cr）、超敏 C 反應蛋白（hs-CRP）、空腹血糖（FBG）。正常值：TG＜1.70mmol/L，TC＜5.18mmol/L，HDL-C 1.29～1.55 mmol/L，LDL-C＜3.1mmol/L，hs-CRP 0.00～3.00mg/L，FBG 3.89～6.1mmol/L。采用彩色多普勒超聲心動圖（德國西門子ACUSON S2000）測量左心室射血分數（LVEF）。

1.2.2 中性粒細胞表面CD99分子檢測 收集經抗凝處理的外周血樣（100μl），采用PE熒光直接標記法，分別與CD99（20μl）單克隆抗體（美國 BD公司，批號：555689）和同型對照抗體（20μl）在 4℃環境下避光孵育20min。加入紅細胞裂解液2ml（北京索萊寶科技有限公司，批號：R1010），避光孵育10min。以2 000r/min離心5min。棄上清液，PBS洗滌2次。采用流式細胞儀（美國BD公司，CantoⅡ型）檢測染色細胞表面CD99的表達百分率，上機檢測前先用標準熒光微球校準流式細胞儀，使變異系數＜2%后開始采集數據，應用CELLQuest軟件對數據進行設門顏色示蹤法分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS25統計軟件，計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗；計數資料以百分率表示，兩組比較采用χ2檢驗；采用多因素logistic回歸分析冠心病的危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料的比較 見表1。

由表1可見，冠心病組高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙率均高于硬化組（均P＜0.01）。冠心病組服用他汀類藥物、β受體阻滯劑、阿司匹林、利尿劑的比例均高于硬化組（P＜0.05 或 0.01）。兩組 BMI差異無統計學意義（P ＞0.05）。

2.2 兩組患者生化指標、LVEF及中性粒細胞CD99分子表達比較 見表2。

表1 兩組患者一般資料的比較

注：ACEI：血管緊張素轉換酶抑制劑；ARB：血管緊張素受體阻滯劑

表2 兩組患者生化指標、LVEF及中性粒細胞CD99分子表達比較

由表2可見，冠心病組患者血清TG、中性粒細胞CD99的表達均高于硬化組，差異均有統計學意義（P＜0.05或 0.01），余指標比較差異均無統計學意義（均 P ＞0.05）。

2.3 冠心病危險因素的多因素logistic回歸分析 見表3。

由表3可見，冠心病與年齡、糖尿病、高血壓、吸煙、TG、TC、LDL-C及中性粒細胞CD99的表達均呈正相關（P＜0.05 或 0.01）。

表3 冠心病危險因素的多因素logistic回歸分析

3 討論

本研究評估了中性粒細胞CD99的表達水平與冠狀動脈疾病之間的關系,提示中性粒細胞CD99表達可能與冠心病的發生、發展有關。動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病[8]，白細胞遷移到損傷的內皮下是動脈粥樣硬化病變形成的早期步驟[9-10]，因此，白細胞和內皮細胞上的黏附分子與動脈粥樣硬化有關，許多黏附分子如P-選擇素糖蛋白配體-1[11]、血小板內皮細胞黏附分子-1[12]、連接黏附分子-A[13]和細胞間黏附分子（ICAM）-1[14]在冠心病患者的血液循環或載脂蛋白E缺陷小鼠的動脈粥樣硬化斑塊中表達上調。CD99是一種高度糖基化的跨膜蛋白，32kDa，在大多數造血細胞和內皮細胞上表達。研究表明CD99是中性粒細胞跨內皮遷移的重要介質[4-5]。Lou等[15-16]認為CD99和血小板內皮細胞粘附分子（PECAM）控制白細胞跨內皮遷移的不同步驟，并且CD99作用在PECAM的下游，阻斷CD99能抑制白細胞與內皮連接處的細胞遷移，另外，Wanrooij等[17]研究表明抗CD99疫苗可以防止低密度脂蛋白受體缺陷的小鼠動脈粥樣硬化的形成。因此，中性粒細胞CD99表達水平增高可能通過促進跨內皮遷移，從而加速動脈粥樣硬化的進展。

參與CD99調節的機制和信號通路目前還不清楚。體外實驗表明，特異性蛋白1（SP1）對CD99的表達有正調控作用，而Epstein-Barr病毒潛伏膜蛋白1通過核因子-κB（NF-κB）負調控 CD99 的表達[18]。CD99 在某些人類腫瘤中表達下調，如胃腺癌和鼻咽癌[19-20]。研究表明CD99能因炎癥刺激或細胞因子而表達上調[17]，動脈粥樣硬化病變過程中炎癥和免疫扮演了重要角色[21]，循環炎癥介質如白介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α和CRP在冠心病患者中升高。因此，冠心病患者中循環炎癥介質的升高可能是導致中性粒細胞CD99表達上調的一個因素。

中性粒細胞在動脈粥樣硬化發病機制中的作用直到最近才被認識[22]，動物和人類的研究表明，中性粒細胞在早期和晚期均參與動脈粥樣硬化的過程[23-25]，中性粒細胞進入動脈壁并維持炎癥惡性循環[26]。Lou等[15]指出，中性粒細胞中有大量的CD99儲存池，當中性粒細胞被激活時，這些CD99被大量釋放。這提示冠心病患者血脂異常及炎癥細胞因子水平升高、氧化應激等因素可能上調中性粒細胞表面CD99的表達，從而招募更多的中性粒細胞進入動脈壁中，加速動脈粥樣硬化的發展。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究的數據來自單一中心。其次，需要更大的樣本量來進一步證實。第三，研究中未設健康對照組。

綜上所述，年齡、糖尿病、高血壓、吸煙、TC、TC、LDL-C、中性粒細胞CD99表達水平與冠狀動脈粥樣硬化呈正相關，可能參與冠心病發展的病理生理過程。中性粒細胞CD99的表達有希望成為一個冠心病發生、發展預防和治療的靶點。