白癜風皮損旁黑素細胞自噬相關蛋白表達的研究

虞海燕 岑建萍 林曉霞 何劍萍 王瑤瑤 程浩

白癜風是一種獲得性的以局部或全身多發色素脫失斑為特征的皮膚疾病。其毀損性的外觀嚴重影響患者的生活質量。迄今，其病因及發病機制未明，為疾病的有效防治帶來困難。多數學者認為白癜風是一種多基因遺傳的自身免疫性疾病，在多種環境因子如氧化應激、神經精神和病毒等因素的激發下出現免疫功能紊亂，導致表皮黑素細胞破壞[1]。氧化應激損傷是目前認為導致黑素細胞功能損傷及黑素細胞丟失的一個重要因素[2]。現已知自噬有助于黑素細胞穩定自身的氧化還原穩態，保護細胞免受氧化損傷，是細胞維持自身穩態的一種重要機制。細胞可通過自噬清除損傷或多余的細胞器進行自我保護，并通過快速而相對簡單的過程清除胞內微生物而參與免疫反應[3]。正常自噬功能有助于均衡免疫反應，從而防止疾病發生。自噬失衡可導致異常的免疫反應而產生疾病，研究已發現許多自身免疫性疾病存在自噬異常如紅斑狼瘡及炎癥性腸病等。自噬的調節對黑素細胞的生理功能也有著重要影響，紫外線抵抗相關基因（ultroviolet radiation resistance associated gene，UVRAG） 能激活自噬相關基因BECN1的相關通路而促進自噬，其基因的多態性與白癜風有關，研究非節段性白癜風的患者發現UVRAG可能與白癜風的易感性有關[4]。另外,敲除自噬相關基因BECN1可導致黑素聚集的下降[5]。然而，自噬在白癜風發病中的作用尚未明了，本研究將利用原代體外黑素細胞培養的方法分離白癜風患者及正常對照的黑素細胞，采用免疫印跡法檢測并比較自噬相關蛋白表達的差異，分析它們與疾病可能的相關性，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 原代培養的白癜風黑素細胞（白癜風組）從泛發型白癜風患者軀干皮損周圍的正常皮膚組織中提取，所取的3例不同白癜風樣本均來自于本院白癜風專科門診的患者，由2位醫生分別確定診斷歸屬于泛發型白癜風，并行伍德燈確定。排除標準：近3個月接受系統藥物治療及光療，軀干部無皮損或軀干部的皮損近1個月使用外用藥物治療者。患者均簽署知情同意書。正常的黑色素細胞（對照組）為來源于本院泌尿外科包皮環切手術3例患者所廢棄的皮膚組織。

1.2 方法

1.2.1 原代黑素細胞培養方法 皮膚組織去除皮下組織，經0.25%Dispase酶4℃共育過夜，分離表皮與真皮，用0.25%胰蛋白酶溶液消化表皮10min，用移液器輕輕吹打。細胞懸浮液經細胞過濾器過濾后1 000r/min離心10min，收獲細胞。黑素細胞在加有100μg/ml選擇抗生素G418（美國Gibco公司）的黑色素細胞培養液（美國Sciencell公司）中選擇性生長。細胞孵育于37℃，5%CO2的培養箱中，2～4代的細胞用于實驗檢測。

1.2.2 自噬相關蛋白表達檢測 采用免疫印跡法。取對數生長期不同來源的黑素細胞，制成細胞懸液，調整細胞密度為1×105/ml，接種于10 mm培養皿內，培養48h后，用蛋白裂解液裂解細胞，測定蛋白含量，用10%聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白質分離，然后轉移到聚乙二烯二氟化物膜，將膜移至含有封閉液5%的脫脂奶粉的平皿中室溫封閉2h，然后分別與相應的抗微管相關蛋白輕鏈 3（microtubule-associated protein-1 light chain 3，LC3）抗體（美國Proteintech公司）、抗 p62抗體（美國Proteintech公司）、抗自噬相關基因5（autophagy related gene 5，Agt 5）抗體（英國 Abcam 公司）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR)抗體（英國Abcam公司）或抗β-actin抗體（美國Cell signalling Technology公司）共育過夜，用TBST緩沖液4℃搖床上洗滌4次，再與連接有辣根過氧化物酶的二抗共育4h。用ECL試劑盒對信號進行可視化。使用掃描密度分析圖像軟件對條帶進行密度掃描。

1.2.3 酪氨酸酶活性測定 采用改良的多巴胺法[6]。調整培養黑素細胞的濃度為1×105/ml，將150ml接種于96孔板中。置于37℃，5%CO2培養箱中培養24h，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌細胞2次，再于每孔加入50μl 1%Triton X-100/PBS裂解細胞，每孔加入100ml 1%L-DOPA置37℃孵育4h后，使用酶標儀測量吸光度。

1.4 統計學處理 采用Graphpad prism6統計軟件，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞LC3Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表達比較 見圖1。

圖1 兩組黑素細胞LC3Ⅱ/Ⅰ及p62蛋白表達（a：蛋白表達電泳圖；b：灰度分析圖，與對照組比較，**P＜0.01）

由圖1可見，白癜風組LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達值為2.71±0.08，顯著高于對照組 1.01±0.18，白癜風組 p62 蛋白表達值為 0.45±0.03，顯著低于對照組 0.71±0.08，差異均有統計學意義（t=10.36、5.12，均 P＜0.01）。

2.2 兩組細胞Atg5和mTOR蛋白表達比較 見圖2。

由圖2可見，白癜風組Atg5蛋白表達值為0.74±0.03，顯著高于對照組 0.49±0.02，白癜風組 mTOR 蛋白表達值為 0.23±0.02，顯著低于對照組 0.39±0.04，差異均有統計學意義（t=13.01、7.22，均 P＜0.01）。

2.3 兩組細胞酪氨酸酶活性比較 白癜風組酪氨酸酶活性為 0.646±0.002，明顯低于對照組 0.784±0.006（t=36.51，P＜0.01)。

圖2 兩組黑素細胞Atg5和mTOR表達（a：蛋白表達電泳圖；b：灰度分析圖，與對照組比較，**P＜0.01）

3 討論

自噬是維持細胞內穩態的一個重要途徑，也是細胞清除自身破損細胞器和降解長壽蛋白必不可少的一個方式[3]，自噬的調節對黑素細胞的生理功能有著重要的影響。本研究結果顯示，白癜風患者皮損旁的黑素細胞在體外培養時自噬標志物LC3Ⅱ/Ⅰ上調、p62蛋白表達降低。LC3是可靠的自噬標志物[7]，它有兩種存在形式LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，當發生自噬時，部分LC3Ⅰ型轉化為LC3Ⅱ型，LC3Ⅱ含量或 LC3Ⅱ和 LC3Ⅰ比值與自噬活性呈正相關。在自噬過程中，與之結合的適配器蛋白p62/SQSTM1被消耗，因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的增高伴隨p62蛋白的下降提示有自噬的增高。本研究結果提示，體外培養的白癜風皮損旁黑素細胞存在有自噬功能的活化。另外，Atg5是自噬體形成過程中所需的一種關鍵蛋白，在自噬囊泡的形成過程中，Atg12聯合Atg5然后與Atg16結合構成Atg12-Atg5-Atg16復合體而附集于膜上輔助自噬囊泡的形成，而mTOR是自噬的一個重要調節蛋白，它可以通過磷酸化使UNC-51樣酶失活而抑制自噬，因此，自噬通路的活化常常伴隨Atg5蛋白的表達增高及mTOR蛋白的下調。本實驗結果顯示,白癜風黑素細胞自噬相關蛋白Atg 5的表達升高、mTOR蛋白表達降低，提示白癜風患者皮損旁的黑素細胞在體外培養時具有自噬通路的活化。

自噬的調節對于黑素細胞黑素的形成具有雙向調節作用[8]。用雷帕霉素誘導自噬可以顯著增加黑色素指數、酪氨酸酶活性以及與黑素體生物合成相關的幾種蛋白的表達，用siRNA抑制并下調LC3可以降低黑色素含量和酪氨酸酶活性[9]。敲除自噬相關基因BECN1可導致黑素含量及黑素顆粒的數量下降[5]。提示促進自噬可以增加黑素細胞合成黑素的功能。然而，與之相反，一種公認的黑素抑制劑白藜蘆醇是通過誘導自噬而抑制黑素刺激素所誘導的黑素合成，而敲除ATG5可顯著抑制白藜蘆醇介導的抗黑素生成以及其誘導的自噬[10]。波長為585nm的發光二極管（light-emitting diode，LED）光調能通過誘導黑素細胞的自噬而抑制黑色素生成，并與光的劑量呈劑量依賴性[11]。此外，抑制黑素小體在細胞內的轉運也可以誘導自噬并降解黑素，以茶堿作用于黑素細胞或下調黑素體運輸的蛋白質的表達，可觀察到酪氨酸酶表達水平顯著下降，以及LC3Ⅱ表達增高和p62表達下降[12]。白癜風患者皮損旁的黑素細胞所顯示的自噬標記物LC3Ⅱ高表達，底物p62低表達以及酪氨酸酶活性的下降，提示白癜風皮損旁的黑素細胞自噬激活可能與其黑素合成功能的下降有關。

現有的證據表明自噬有助于黑素細胞穩定自身的氧化還原穩態，保護細胞免受氧化損傷，自噬缺陷的黑素細胞對于紫外線照射后產生的氧化損傷以及黑素細胞的早衰起著一定作用[13]，Atg7缺失的黑素細胞顯示有明顯的生長停滯、氧化損傷和多功能適配蛋白p62的堆積[13]。在白癜風的發病中，氧化應激損傷可能是導致黑素細胞功能損傷及黑素細胞丟失的一個重要因素[2]，氧化應激所產生的活性氧和活性氮是維持自噬的主要細胞內信號轉導因子[14]。因此，我們推測本研究所顯示的體外培養白癜風黑素細胞所呈現的自噬增高可能是黑素細胞穩定自身氧化還原平衡，保護細胞免受氧化損傷的一種自身保護機制。自噬在白癜風發病中的作用可能與黑素細胞氧化還原平衡破壞有關[15]。但其詳細機制還需進一步的研究闡明。

綜上所述，來自于泛發型白癜風皮損旁的黑素細胞呈現有自噬通路的激活同時伴有黑素形成所需的酪氨酸酶活性降低，提示黑素細胞中自噬的活化可能與黑素細胞功能異常及白癜風的發病有關，推測自噬的增高可能是機體對于氧化還原失衡的一種自身保護機制。基于本研究的樣本量較少，需進一步擴大樣本量研究證實，同時自噬在白癜風發病中的具體作用也需進一步的研究闡明。