柴胡皂苷D對H2O2誘導大鼠心肌細胞H9c2損傷保護機制研究

丁雨 陳雪梅 吳思思

在心血管疾病的發生中，活性氧自由基增多導致的細胞凋亡與各類心血管疾病的發生、發展密切相關，如心肌梗死、冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等[1-5]。另外心血管疾病的治療方式，如心臟外科體外循環、心肺腦復蘇等的建立，雖為患者解決了病患，但再灌注損傷并發癥仍會影響患者愈后，而氧化應激反應導致的氧自由基增多是心肌缺血再灌注引起損傷發生的重要病理基礎[6]。所以降低氧化應激反應水平，避免細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量產生，對心肌損傷具有保護作用[7-11]。柴胡皂苷為柴胡的主要活性成分，研究者利用現代萃取工藝對柴胡進行分離提純，已存在柴胡皂苷A、B、C、D等150多種[12]。隨著中醫的發展，中藥成分研究的不斷深入，柴胡皂苷的作用及其機制的研究也越來越廣泛，大量文獻報道柴胡皂苷除了抗抑郁、解毒保肝等傳統中醫治療作用外[13-15]，還能通過誘導腫瘤細胞凋亡[16]、誘導腫瘤細胞分化為正常細胞[17-18]、抑制腫瘤血管產生[19]、抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[9，20-21]等產生抗腫瘤作用。但是柴胡皂苷對心肌功能的作用研究鮮有報道，本文旨在探討柴胡皂苷D對心肌損傷是否具有保護作用，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 大鼠心肌細胞（H9c2）由本中心保存；柴胡皂苷D購自成都普菲德生物技術有限公司；2，7-雙乙酸二氯熒光素（DCFH-DA）購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物技術有限公司；Hoechst染液購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒購自美國Promega公司；逆轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；CCK-8檢測試劑購自日本同仁化學研究所；DMEM高糖培養基、PBS緩沖液購自美國HyClone公司；細胞培養板、細胞培養瓶及凍存管等購自美國Corning公司；其他試劑均為國產分析純。本研究所用儀器如下：Synergy Mx多功能熒光酶標儀為美國Bio-Tek公司產品；Cytoflex流式細胞儀為美國 Beckman Coulter公司產品；Connect Real-time PCR儀為美國BIORAD公司產品；Integral 10純水儀為美國Millipore公司產品；二級生物安全柜、三氣培養箱為美國Thermo公司產品；SX-700高壓滅菌鍋為中國TOMY公司產品；CO2培養箱為德國Binder公司產品。

1.2 方法

1.2.1 H9c2大鼠心肌細胞培養 使用 Low Glucose DMEM（含10%FBS）培養H9c2細胞，環境條件為37℃、5%CO2，每2d換液一次。當細胞融合率達到85%～90%，用含EDTA的0.25%胰酶消化H9c2細胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，用培養基重懸，調整細胞濃度至1×105個/ml，分別接種到 96 孔板、12 孔板中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養。

1.2.2 建立H2O2誘導心肌細胞氧化損傷模型 當細胞融合率達到85%～90%，用含EDTA的0.25%胰酶消化H9c2細胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，用培養基重懸，接種至24孔板中培養，每孔1×105個細胞。培養24h后，將H2O2稀釋至終濃度為400μM，再分別作用4h，利用Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡情況。正常細胞形態完整，核染色均勻；凋亡細胞則表現為細胞核固縮突亮或者碎塊狀致密濃染。

1.2.3 柴胡皂苷D處理后細胞凋亡情況觀察 將細胞懸液接種至12孔培養板培養24h后，實驗分別設置對照組、H2O2誘導心肌損傷模型組（簡稱模型組）、預先用柴胡皂苷 D（濃度分別用 1μM、4μM、16μM）預處理 3h再加入 400μM H2O2處理4h的實驗組（分別簡稱1μM實驗組、4μM實驗組、16μM實驗組）。PBS清洗3次，然后 37℃條件下 Hoechst 33258（1mg/L）孵育 10 min，再次PBS清洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 柴胡皂苷D處理后細胞凋亡情況檢測 將細胞懸液接種至12孔培養板培養24h后，實驗分別設置對照組、H2O2誘導心肌損傷模型組（簡稱模型組）、用4μM的柴胡皂苷D預處理3h后再加入400μM H2O2處理4h的實驗組（簡稱4μM實驗組）。用含EDTA的0.25%胰酶消化H9c2細胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，PBS洗2次，去除EDTA的干擾，用四正柏Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑進行孵育，再利用流式細胞儀完成凋亡檢測。

1.2.5 細胞內ROS檢測 將細胞懸液接種至黑色不透光24孔培養板培養24h，按照1.3.4中實驗方法處理細胞，H2O2處理后棄掉培養基，用PBS洗2次，分別加入用Low Glucose DMEM（無FBS）稀釋的終濃度為10μM的DCFH-DA。置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱內，孵育20 min。孵育完成后，用PBS洗滌細胞3次，以充分除去未進入細胞內的DCFH-DA，防止液體本底熒光強度過高。將24孔板置于Synergy Mx多功能熒光酶標儀上，設置參數直接檢測孔板中H9c2細胞內的熒光強度。冰上，將檢測完的細胞用RIPA緩沖液裂解細胞30min，13 000 r/min離心15 min，收集上清液。用BCA法檢測總蛋白含量，熒光值/蛋白質量（AFU/μg）使結果標準化。

1.2.6 LDH、MDA含量測定 將細胞懸液接種至24孔培養板培養24h后，按照1.3.4中實驗方法處理細胞，收集細胞上清檢測LDH含量，細胞用RIPA緩沖液裂解細胞30min，13 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA法檢測總蛋白含量，然后利用檢測試劑盒測定MDA含量。

1.2.7 過氧化物酶體增殖子活化受體（peroxisome proliferator-activated receptors,PPARγ）、核因子 E2相關因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）基因水平的表達情況檢測 將細胞懸液接種至24孔培養板培養24h后，按照1.3.4中實驗方法處理細胞，收集細胞用試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模版進行Real-time PCR檢測。逆轉錄條件:42°C 15min，85℃5s，12℃ 20min，PCR 擴增條件:94℃ 2min，94℃ 10s，60℃ 30s，40個循環。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.3 統計學處理 采用Graphad prism 6.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用One-way ANOVA Tukey's檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H9c2大鼠心肌細胞氧化損傷模型建立及各組細胞凋亡情況檢測 見插頁圖1及圖2。

由插頁圖1可見，與對照組相比，模型組大量H9c2心肌細胞出現細胞核濃染、細胞體積縮小、部分核破裂的凋亡表現，表明心肌細胞氧化損傷模型成功建立。與模型組相比，1μM、4μM、16μM 實驗組的凋亡細胞減少。由圖 2 可見，與對照組（11.72%±1.84%）相比，模型組的細胞凋亡率（16.99%±2.14%）顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，4μM 實驗組的凋亡率（9.17%±2.07%）下降（P＜0.05）。

2.2 細胞內ROS含量檢測結果 見圖3。

由圖3可見，與對照組[（17.28±1.66）FU/μg]相比，模型組ROS含量[（36.15±2.31）FU/μg]升高（P＜0.05）；而與模型組相比，4μM實驗組ROS含量[（23.25±1.313）FU/μg]下降（P＜0.05）。

2.3 細胞內LDH、MDA含量檢測結果 見圖4。

圖2 各組H9c2心肌細胞流式細胞儀檢測結果（與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05）

圖3 細胞內ROS含量檢測結果（與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05）

圖4 細胞內LDH、MDA含量檢測結果（與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05）

由圖 4 可見，與對照組［（149.7±4.3）U/L］比較，模型組 LDH 含量［（252.9±2.1）U/L］升高（P＜0.05）,而與模型組相比，4μM 實驗組的 LDH 含量［（201.7±7.2）U/L］下降（P＜0.05）；與對照組［（1.60±0.30）nmol/mg］比較，模型組的 MDA 含量［（5.28±0.14）nmol/mg］升高（P＜0.05），而與模型組比較，4μM 實驗組的 MDA 含量 ［（2.60±0.41）nmol/mg］下降（P＜0.05）。

2.4 Nrf2、HO-1 和 PPARγ mRNA 水平表達情況的檢測結果 見圖5。

圖5 Nrf2、HO-1和PPARγmRNA水平表達情況的檢測結果（與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05）

由圖 5 可見，與模型組（1.68±0.06）比較，4μM 實驗組 Nrf2 的 mRNA 表達（2.18±0.16）增加（P＜0.05）；與模型組（1.47±0.06）比較，4μM 實驗組 HO-1 的 mRNA 表達（1.79±0.18）增加（P＜0.05）；與模型組（0.90±0.11）比較，4μM 實驗組 PPARγ 的 mRNA 表達（1.47±0.18）增加（P＜0.05）。

3 討論

很多研究報道氧化應激反應是引起心肌損傷的主要病理原因，在心肌缺血再灌注的過程中產生的大量ROS、氧化損傷DNA、蛋白質、脂類等，造成細胞內結構、功能的破壞，從而導致心肌細胞凋亡[9]。H2O2是一個重要氧化反應分子，參與很多重要胞內反應，如轉錄因子激活、基因表達、細胞增殖，但是過量的H2O2會增強胞內的氧化應激反應，損傷胞內的各種分子而導致心肌細胞凋亡[9，22]。

為了確定柴胡皂苷是否具有抗氧化保護作用，本文參考文獻[22-23]采用適量的H2O2（400μM）誘導體外心肌損傷模型。心肌損傷模型成功建立后，加入柴胡皂苷D，Hoechst 33258染色及流式細胞凋亡檢測結果顯示柴胡皂苷D處理后凋亡細胞量較模型組明顯降低，表明柴胡皂苷D可能對H2O2誘導的心肌細胞損傷具有保護作用。細胞內大量氧自由基的存在，會造成膜上不飽和脂肪酸過氧化作用，從而引起細胞損傷，MDA就是過氧化物產物之一，而細胞膜的損傷也會使原本穩定存在胞內的LDH釋放出來，因此檢測LDH、MDA含量可表明細胞內氧化應激反應程度[24]。本實驗結果顯示，柴胡皂苷處理后細胞ROS、LDH、MDA含量明顯降低,說明柴胡皂苷D能夠降低H2O2引起的心肌細胞內的氧化應激反應。

Nrf2是一種普遍存在的多效性轉錄因子，是細胞內應激的主要基因組穩態調節因子，對哺乳動物細胞內氧化還原平衡和保護性的抗氧化反應起調節作用[25-27]。HO-1是Nrf2調控的基因之一，主要起到抗氧化防御力，當氧化應激發生時，Nrf2入核啟動抗氧化物酶HO-1的表達，增強機體抗氧化應激的反應能力[28]。已有大量研究證明了通過啟動Nrf2/HO-1通路能降低氧化應激反應，對細胞損傷具有保護作用，如IcarisideⅡ通過Nrf2/HO-1降低氧化反應對缺血性腦損傷起到保護作用，天麻素通過p38-MAPK磷酸化誘導Nrf2/HO-1上調從而減輕H2O2誘導的小鼠肝竇內皮細胞氧化應激，綠原酸通過PI3K/Akt介導的Nrf2/HO-1信號通路對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞氧化應激的保護作用，Embelin可激活Nrf-2/HO-1途徑，減輕順鉑引起的腎毒性，花青素通過PI3K/Akt/Nrf2/HO-1途徑減輕阿爾茨海默病小鼠模型中的氧化應激[29-33]。

在以往研究中PPARγ在調節葡萄糖和脂質代謝方面有著重要的作用。而最近研究發現其在抗炎、抗氧化反應調節中也發揮著作用。PPARγ和Nrf2之間可能涉及多種機制的相互作用，從而在抗炎、抗氧化反應調節中發揮作用[31]。PPARγ可能與Nrf2啟動子上的過氧化物酶體增殖物反應元件（peroxisome proliferator responsive element，PPRE）結合，激活 Nfr2 ，當氧化反應增強時，PPARγ表達增加，即可上調Nrf2的表達，從而增強細胞對氧化應激的抵抗能力[31-33]。本文采用熒光定量的方法檢測mRNA水平上Nrf2、HO-1、PPAR-γ的表達情況，相較于模型組，柴胡皂苷D組3個指標的表達均增加，可能表明柴胡皂苷D可上調Nrf2、HO-1、PPAR-γ基因的表達，增強細胞對氧化應激反應的抵抗能力。

綜上，柴胡皂苷D可能對H2O2誘導的心肌細胞損傷有保護作用，并可能通過激活 PPAR-γ/Nrf2/HO-1通路，增強心肌細胞對氧化應激的抵抗能力，降低對細胞的損傷。