膀胱癌組織中PAK2表達及對癌細胞活性的影響

韓昵薇 劉蘭 段妔 張能 吳濤 羅旭

(遵義醫科大學附屬醫院 1檢驗科，貴州 遵義 563000；2泌尿外科)

膀胱癌具有增殖快，侵襲能力強的特點，嚴重威脅患者生命安全〔1〕。放化療和手術是目前臨床治療膀胱癌的主要手段，但療效欠佳，高復發率導致患者5年生存率偏低〔2〕。近年來分子生物學的快速發展為膀胱癌的治療帶來了新希望，但由于尚未闡明膀胱癌發生、發展的分子機制，導致缺少膀胱癌診治的分子標志物〔3〕。Ras相關的C3肉毒素底物(Rac)、細胞分裂周期蛋白(Cdc)42等小分子三磷酸鳥苷(GTP)酶共同構成了腫瘤發生與惡化的信號轉導通路，p21激活激酶(PAK)是Rac、Cdc42的作用底物，分為Ⅰ類(PAK1、PAK2、PAK3)、Ⅱ類(PAK4、PAK5)〔4〕。研究者發現，PAK1在肝癌、甲狀腺癌、膀胱癌等多種癌癥組織和細胞中存在高表達，下調PAK1表達可有效抑制腫瘤的增殖和轉移〔5～7〕。本研究通過免疫組化法檢測PAK2在膀胱癌組織中的表達，并通過慢病毒載體轉染技術在體外構建PAK2基因沉默的膀胱癌細胞株，探討PAK2表達對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象 2016年6月至2018年3月行手術治療的膀胱癌患者108例，其中男80例，女28例；年齡26～82〔平均(62.95±9.30)〕歲；腫瘤直徑≤3 cm 72例，>3 cm 36例；病理分級低級別58例，高級別50例；病理分期≤T1期78例，>T1期30例；出現淋巴轉移24例。收集膀胱癌組織標本108份，癌旁正常膀胱上皮組織標本24份。本研究經醫院倫理委員會批準，患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2材料與主要試劑 人膀胱癌細胞系BIU-87、人正常膀胱上皮細胞系SV-HUC-1購于上海素爾生物科技有限公司；PAK2基因干擾序列(PAK2-shRNA)、無義序列(siRNA)由上海士鋒生物科技有限公司合成；慢病毒載體購于上海伯易生物科技有限公司；鼠抗人PAK2 單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠免疫球蛋白(Ig)G購于北京博爾邁生物技術公司。

1.3免疫組化染色 取標本組織切片，常規脫蠟至水，高壓修復抗原，3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶，封閉20 min后滴加一抗：鼠抗人PAK2 單克隆抗體，1∶200倍稀釋，4℃過夜，滴加HRP標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h。結果判定：細胞中出現黃色或棕黃褐色為陽性，陽性細胞比例評分標準為：無陽性計0分、陽性細胞比例<25%計1分、25%～50%計2分、51%～75%計3分、>75%計4分。染色強度評分標準：無染色計0分、淡黃色計1分、黃色計2分、棕黃色計3分。以陽性細胞比例評分和染色強度評分之和判斷PAK2表達，0～4分為陰性，5～7分為陽性。

1.4細胞培養與轉染 BIU-87和SV-HUC-1細胞均放入含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中，5%CO237℃培養箱中培養，傳至5～6代時用于實驗。分別使用含siRNA慢病毒載體(對照組)、PAK2-shRNA慢病毒載體(PAK2基因沉默組)轉染BIU-87細胞，繼續培養48 h，通過實時熒光-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western印跡驗證BIU-87細胞中PAK2 mRNA和蛋白表達情況。

1.5細胞增殖能力檢測 制備對照組和PAK2基因沉默組細胞懸液，調整細胞密度至1×105/ml；加入96孔板，100 μl/孔，設置5個平行對照，放入5%CO237℃培養箱中分別培養24、48、72 h，棄去培養液，每孔加入100 μl細胞計數試劑盒(CCK)-8檢測液，繼續培養4 h，酶標儀讀取450 nm波長處的吸光度值。

1.6Transwell細胞遷移和侵襲能力檢測 細胞遷移實驗：取兩組對數期細胞消化、重懸計數后，向上室中加入3×105個細胞，下室加入600 μl DMEM完全培養基，5%CO237℃培養箱中培養48 h；4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色10 min，封片后在光學顯微鏡下隨機選取10個視野計數細胞數量。細胞侵襲實驗：基底膠與不含胎牛血清的DMEM培養基按1∶15比例混合，取100 μl加入上室，成膠后加入3×105個細胞，其余步驟同遷移實驗。

1.7RT-PCR檢測 Trizol提取對照組和PAK2基因沉默組細胞RNA，逆轉錄得到cDNA。引物序列由南京信帆生物技術有限公司合成，PAK2引物序列：上游5′-AGTAGTAGGAGTAGAAGACTTTGA-3′，下游5′-GACATATGTGTGCCAGACACTAAA-3′；GAPDH引物序列：上游5′-TAGTAGTCGTTACGGAGGAC-3′，下游5′-TTTACTCGGGGTCGGAAG-3′。反應體系30 μl，反應條件：95℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環，延伸72℃ 5 min。產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計算目標條帶 mRNA的相對表達量。

1.8Western印跡檢測 放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取對照組和PAK2基因沉默組細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，各點樣孔加入等質量的蛋白樣品，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，目標蛋白經濕法電轉膜到聚偏氟乙烯膜，封閉后分別滴加鼠抗人PAK2單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人GAPDH多克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜，滴加HRP標記的鼠抗人IgG(1∶2 000)，室溫孵育1 h，電化學發光顯色，暗室中顯影，分析各條帶灰度值。

1.9統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1膀胱癌組織中PAK2表達情況 PAK2呈黃色或棕黃色表達于細胞質中，108份膀胱癌組織中PAK2陽性表達56份(51.85%)；24份癌旁正常膀胱上皮組織中PAK2陽性表達2份(8.33%)；膀胱癌組織中PAK2陽性表達率明顯高于癌旁正常膀胱上皮組織(P<0.01)。見圖1。

圖1 PAK2在不同組織中的表達(SP，×200)

2.2不同臨床病理指標膀胱癌患者中PAK2陽性率比較 不同腫瘤直徑、病理分級、病理分期、淋巴結轉移情況的膀胱癌患者中PAK2陽性率差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。其中腫瘤直徑>3 cm、病理分級偏高、病理分期>T1、合并淋巴結轉移的PAK2陽性率明顯偏高。見表1。

表1 不同臨床病理指標膀胱癌患者中PAK2陽性率比較〔n(%)〕

2.3PAK2在不同細胞系中表達情況 SV-HUC-1細胞、BIU-87細胞中PAK2 mRNA相對表達量分別為2.36±0.41、4.21±0.63；PAK2蛋白相對表達量分別為1.95±0.28、3.68±0.50。BIU-87細胞中PAK2 mRNA和蛋白相對表達量明顯高于SV-HUC-1細胞(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同細胞中PAK2 mRNA的表達

2.4成功構建PAK2基因沉默的人膀胱癌細胞系BIU-87 轉染48 h后，對照組、PAK2基因沉默組BIU-87細胞中PAK2 mRNA相對表達量分別為4.18±0.31、0.95±0.17；PAK2蛋白相對表達量分別為3.71±0.28、0.63±0.10。PAK2基因沉默組BIU-87細胞中PAK2 mRNA和蛋白相對表達量明顯低于對照組(P<0.01)。見圖3。

圖3 兩組細胞中PAK2蛋白的表達

2.5兩組細胞增殖情況分析 轉染前兩組細胞增殖情況差異無統計學意義(P>0.05)；隨著轉染時間的延長，對照組和PAK2基因沉默組細胞增殖水平均逐漸增加，轉染48 h、72 h 后PAK2基因沉默組細胞增殖情況明顯低于對照組(P<0.01)。見表2。

2.6兩組細胞遷移和侵襲能力比較 Transwell細胞遷移實驗顯示，PAK2基因沉默組遷移細胞數〔(20.38±5.72)個〕明顯低于對照組〔(56.81±10.95)個,P<0.01〕；細胞侵襲實驗顯示，PAK2基因沉默組侵襲細胞數〔(14.75±3.90)個〕明顯低于對照組〔(36.29±5.70)個，P<0.01〕。見圖4。

表2 各組細胞增殖情況分析

圖4 Transwell細胞遷移和侵襲實驗(×200)

3 討 論

隨著我國人口老齡化加劇，膀胱癌發病率呈快速增長趨勢〔8〕；腫瘤細胞的增殖和侵襲是膀胱癌患者病情發展和死亡的主要原因。細胞核分子結構和染色體變化導致抑癌基因活性喪失或下降，原癌基因被激活，相關分子通路活化共同促進了膀胱癌的發生與發展〔9〕。PAK2為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，介導細胞生長、凋亡等多個過程〔10〕。相關研究顯示，在胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤細胞中均發現PAK2高表達，且PAK2表達水平與腫瘤細胞生長、轉移、凋亡明顯相關〔11，12〕；但PAK2在膀胱癌組織和細胞中的表達及作用仍鮮有報道。本研究提示PAK2高表達可能介導膀胱癌病情的發展和惡化，監測PAK2表達可用于判斷膀胱癌病變程度，評估患者預后水平。

相關研究顯示，PAK2可通過上調其下游蛋白細胞外調節蛋白激酶(Erk)、蛋白激酶B(Akt)的表達，促進胃癌細胞增殖〔13〕。結合本研究結果推測沉默PAK2基因可能通過降低Erk、Akt的活性來抑制膀胱癌細胞增殖。

遷移和侵襲是腫瘤細胞的主要生物學特征之一，也是導致多數腫瘤患者死亡的原因，目前仍無較好的防治方法〔14〕；探討影響腫瘤細胞遷移和侵襲的分子機制對改善患者預后具有重要意義。本研究提示沉默PAK2基因表達可明顯抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力。相關研究顯示，上調PAK2表達可明顯提升肝癌細胞的遷移和侵襲能力，其作用機制可能與PAK2高表達激活了細胞外調節蛋白、應激活化蛋白激酶等細胞信號傳遞中的調控蛋白，介導肝癌細胞的遷移和侵襲過程〔15〕。上述研究與本研究類似，但PAK2基因調控膀胱癌細胞遷移和侵襲的具體分子機制仍需進一步研究。