神經生長因子在慢性阻塞性肺疾病大鼠血、肺組織、支氣管灌洗液中的表達

李渺苗 邵宏濤 李寧 孔鋮英 孫麗 蔣濤

(1浙江大學醫學院附屬第四醫院呼吸與危重癥學科，浙江 義烏 322000；2南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院；3江蘇省中醫藥研究院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限為特征的疾病，氣流受限不完全可逆、并呈進行性發展〔1〕。吸煙是COPD的主要危險因素，慢性炎癥是COPD發病的中心環節，但令人費解的是，即使戒煙后肺部的炎癥仍然存在，所以炎癥一旦啟動，就會一直持續存在，并進行性加重，形成惡性循環〔2〕。目前缺乏統一標準的COPD動物模型構建方法，尤其是在停止造模干預后仍顯示出COPD的特征性變化的造模方法。神經生長因子(NGF)在肺組織中廣泛表達，在不同微環境下，NGF通過表達變化及介導細胞功能的發揮參與肺部疾病的發生發展，如支氣管哮喘、肺結節病、肺癌、肺纖維化等〔3〕。研究發現香煙刺激COPD大鼠肺巨噬細胞高表達NGF〔4〕。因此觀察NGF在COPD、戒煙COPD中的表達變化有助于進一步闡述COPD炎性持續存在的發病機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠24只，平均體重(145±15)g，清潔級，由南京軍區南京總醫院比較醫學科提供。實驗動物合格證號：SCXK(軍)2012-0014。

1.2試劑與儀器 大豐收牌香煙由中國煙草總公司監制(含焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)；NGF上下游引物由南京金斯瑞公司合成；總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自Takara大連寶生物有限公司；實時熒光定量PCR儀為美國ABI StepOne定量PCR儀；大鼠NGF ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3動物模型的建立 將24只大鼠按隨機數字表法分為正常對照組、COPD組，戒煙1個月COPD組，每組8只。采用單純煙熏法建立COPD大鼠模型：將大鼠置于自制的熏箱(70 cm×50 cm×30 cm)內，每次點燃5只香煙，2次/d，共暴露2 h/d，每周5 d，連續6個月。戒煙1個月COPD組：按COPD大鼠模型進行香煙刺激6個月后，停止香煙刺激1個月。正常對照組亦同時放入另一相同自制熏箱做偽暴露，余飼養條件相同。

1.4肺組織病理HE染色 2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠(30 mg/kg)，心臟抽血處死，將右上肺浸入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，4 μm連續切片，脫蠟，HE染色，脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察。

1.5支氣管肺泡灌洗進行細胞分類計數 麻醉大鼠后，75%酒精浸泡消毒2～3 min，移至超凈工作臺，固定四肢，逐步暴露氣管后，絲線結扎上端氣管防止灌洗液倒流，靜脈留置針行氣管穿刺，成功后退金屬內芯并將塑料套管緩慢送入氣管約1 cm，經套管注入PBS行支氣管肺泡灌洗，每次5 ml，共6次，灌洗時輕柔按摩雙肺1 min后回吸。收集灌洗液后，1 000 r/min離心10 min，DMEM重懸細胞，在光鏡下行有核細胞計數。吸取100 μl細胞懸液行細胞涂片，經瑞士吉姆薩染色。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定3組大鼠血、肺組織、支氣管肺泡灌洗中NGF蛋白表達 取3組大鼠右下肺0.5 mg左右，充分剪碎，研磨，加入約 500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分混勻，5 000 r/min離心10 min，取上清。取3組大鼠血液2 ml，1 000 r/min離心5 min，取上清。收集支氣管灌洗液后，1 000 r/min離心10 min，取上清。配制1 000.0 pg/ml，500.0 pg/ml，250.0 pg/ml，62.5 pg/ml，31.3 pg/ml，15.6 pg/ml的標準品，并依次加入一排7個孔中，1孔只加樣品稀釋液做為零孔。其余孔加入樣品稀釋液稀釋的上清液100 μl，酶標板加上蓋，37℃反應90 min，甩去酶標板的液體，對著吸水紙拍4次，不洗，加入NGF抗體工作液100 μl，37℃反應60 min，甩去液體，PBS洗3次，每次1 min，加入100 μl ABC工作液，37℃反應30 min，甩去液體，PBS洗5次，每次1 min，加入90 μl TMB顯色液，37℃避光反應25 min，加入100 μl TMB終止液，用酶標儀在460 nm測定OD值。

1.7實時熒光定量PCR檢測3組大鼠肺組織、支氣管灌洗液NGF mRNA表達 按照總RNA提取試劑盒提取的總RNA，并測量RNA的濃度，根據逆轉錄試劑盒操作合成cDNA，反應條件(30 μl反應體系)為：37℃ 30 min，85℃ 5 s。NGF上游序列為5′-CACTCTGAGGTGCATAGCGT-3′，下游序列為5′-GCTTCAGGGACAGAGTCTCC-3′，內參照GAPDH上游序列為5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，下游序列為5′-AGGTGGAAGAATGGGAGTTG-3′。實時熒光定量PCR反應體系采用SYBR GreenⅠ，其最終反應體系為20 μl，采用兩步法擴增，最后得到熒光閾值循環數(Ct值)。NGF mRNA相對表達量用2-ΔΔCt進行比較。ΔCt目的基因=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCtCOPD組-ΔCt正常對照組。

1.8統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件包進行單因素方差分析、LSD檢驗。

2 結 果

2.1大鼠肺組織HE染色 COPD組、戒煙1個月COPD組大鼠肺組織HE染色均可見肺泡壁變薄、肺泡間隔破裂、肺泡腔不規則擴大，部分融合形成肺大皰，肺氣腫形成明顯，見圖1。

圖1 各組肺組織病理改變(HE，×100)

2.2大鼠肺功能檢測結果 相比正常對照組，COPD組、戒煙1個月COPD組肺順應性和每分鐘通氣量均明顯下降，氣道阻力明顯升高(均P<0.05)。見表1。COPD組戒煙1個月COPD組均出現氣流受限，肺通氣功能障礙，即使戒煙，COPD大鼠仍存在肺通氣功能障礙。

2.3支氣管肺泡灌洗液細胞分類 正常對照組支氣管灌洗夜中白細胞總數及肺泡巨噬細胞，明顯少于COPD組、戒煙1個月COPD組(P<0.05)。肺泡巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞所占比例在3組無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表1 各組肺功能檢測結果

與正常對照組比較：1)P<0.05，下表同

表2 各組支氣管肺泡灌洗液中白細胞總數及細胞分類

2.4NGF蛋白的表達 正常對照組、COPD組、戒煙1個月COPD大鼠血中NGF蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。相比正常對照組，COPD組、戒煙1個月COPD組大鼠肺組織、支氣管肺泡灌洗液中NGF蛋白表達明顯升高，但兩組間無明顯差異(P>0.05)。見表3。

表3 各組NGF蛋白在血、肺組織、支氣管肺泡灌洗液中的表達

2.5NGF mRNA的表達 COPD組、戒煙1個月COPD組大鼠血中NGF mRNA表達分別是正常對照組的(1.76±0.25)倍及(1.34±0.15)倍，但3組間差異無統計學意義(P>0.05)。COPD組、戒煙1個月COPD組大鼠肺組織及支氣管肺泡灌洗液中NGF mRNA分別是正常對照組的(24.76±5.99)倍、(25.32±5.45)倍及(23.34±3.50)倍、(26.32±7.45)倍，差異有統計學意義(P<0.05)。COPD組與戒煙1個月COPD組大鼠肺組織、支氣管肺泡灌洗液NGF mRNA表達無明顯差異(P>0.05)。

3 討 論

目前根據COPD的致傷因素把COPD模型的建立方法分為單一因素誘導、復合因素誘導模型〔5〕。單一因素包括：吸入有毒、有害氣體(香煙煙霧、二氧化硫、氯化鎘等)〔6〕；氣管內注入豬胰彈性蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、LPS等化學藥物；鼻多次吸入肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌；基因調控模型〔7〕。復合因素建立在慢性煙霧暴露基礎上聯合氣管內注入蛋白酶或脂多糖〔8〕。關于采用何種動物模型，主要根據臨床上常見的誘因、研究目的、動物種屬和實驗條件決定。吸煙是導致COPD發生發展的最主要環境因素，90%的COPD患者為吸煙者，香煙煙霧中含有一氧化碳、氮氧化物、氨、丙烯醛、對苯二酚、煙堿、氫氰酸等在內的4 500多種化合物。吸入這些有害物質可以使氣道纖毛脫落、倒伏、不規則，纖毛運動發生障礙，降低局部清除能力，并直接損傷氣道上皮細胞，增加病毒及細菌的感染，引起支氣管痙攣，增加氣道阻力〔9〕，長期的煙霧刺激還使黏膜下腺體過度增生，杯狀細胞分泌過多，加強氣道阻塞，大量氧化劑和自由基可以激活巨噬細胞、T細胞(尤其是CD8+T細胞)、中性粒細胞在肺部浸潤，激活的這些炎性細胞分泌白細胞介素-1、白細胞介素8、腫瘤壞死因子等多種炎性因子及中性粒細胞蛋白酶、基質金屬蛋白酶、α-胰蛋白酶等蛋白酶類從而引起氣道、肺實質、肺血管的慢性炎癥和肺組織的破壞〔10〕。因此單一煙熏模型更符合COPD的發病過程和病理改變，被動吸煙可以誘導出最真實的COPD〔11〕，因此本實驗采用單一煙熏法建立COPD模型。

煙霧暴露的時間要長達數月〔12〕，如6個月或者更長時間可使肺氣腫形成越典型，可能是因為肺實質的修復相關的基因在香煙暴露3個月時明顯下降，6個月時下調更明顯，從而造成肺實質的破壞，形成肺氣腫〔9〕，其中以大鼠、小鼠、豚鼠最為常用。有研究顯示SD大鼠每天暴露于10支香煙的煙霧中，連續16 w，肺病理顯示肺氣腫形成，支氣管周圍及血管周圍炎性細胞浸潤，可以成功復制COPD模型〔13〕。若每次同時點燃5支香煙，每天暴露4次，每周6 d，連續80 d，肺功能及肺組織病理提示也可以成功建立COPD模型。若采用早晚各1次，每次1 h，1支香煙燃燒約15 min，間隔5 min，再燃燒另1支，每次共燃燒3支香煙的方法，連續36 w，24 w時成功復制肺氣腫及氣道重塑模型，但肺功能在36 w時才有統計學差異〔14〕。在臨床中，即使戒煙，COPD的炎癥仍繼續發展，肺功能仍在下降，建立戒煙后COPD模型利于對COPD發病機制的探討〔5〕。因此延長被動吸煙時間、加大煙霧刺激量，采用6個月單純煙煙熏法建立的COPD模型，即使戒煙，大鼠肺組織HE染色仍證實肺氣腫、肺大泡的形成，肺功能證提示氣流仍受限，支氣管灌洗液中炎性細胞持續浸潤，這對研究COPD發生發展的機制提供良好的動物模型。

體內外實驗證明NGF介導細胞的存活、增生、分化和活化。NGF在肺組織的結構細胞及炎性細胞有一定的基礎量表達，這有助于細胞的存活及生理功能的發揮〔15〕。有研究表明如果肺組織缺乏NGF受體，動物的早期死亡率升高，NGF可能通過上調bcl-2表達及激活核轉錄因子κB抑制單核細胞、肥大細胞、上皮細胞、B細胞的凋亡〔16〕。本實驗結果提示NGF持續參與COPD肺部炎性反應。

本實驗觀察到香煙刺激的大鼠氣管灌洗夜中中性粒細胞、巨噬細胞數目明顯增多，這與相關研究相同〔17〕。肺泡巨噬細胞強大的吞噬作用、抗原提呈能力，分泌及調節炎性因子和蛋白酶的功能在COPD發病中起到關鍵作用〔18〕，在COPD急性發作期，中性粒細胞浸潤增多〔19〕。研究表明NGF可以上調單核巨噬細胞表面趨化因子受體4，增強其趨化性。在脂多糖刺激下，單核巨噬細胞高表達NGF和TrkA，并呈濃度、時間依賴性，高表達的NGF通過結合單核細胞表面的TrkA激活ERK1/2及部分c-Jun氨基末端激酶上調腫瘤壞死因子-α表達，而預先用NGF抗體拮抗內源性NGF后，在脂多糖刺激下單核巨噬細胞凋亡明顯增多〔20〕。以上研究提示在急性炎癥時，NGF介導巨噬細胞的存活并調節功能的發揮。在我們前期研究發現，香煙刺激COPD大鼠肺泡巨噬細胞高表達NGF及其受體〔4〕，增多的NGF與受體TrkA結合是否介導肺泡巨噬細胞、中性粒細胞在肺部的存活及調控細胞功能，從而參與COPD的進程，這需要深入研究。