血小板微粒與缺血性腦卒中診療的研究進展

李慶運，曾俊玲 綜述 陳煜森 審校

廣東醫科大學附屬醫院神經內科，廣東 湛江 524001

腦血管疾病是危害人類生命和健康的疾病譜中最重要的疾病之一。全球每年約有1 500萬患者被診斷為中風，其中約有500萬人死亡，是全球第二致死病因，也是長期致殘重要病因[1]，在中國每年約240 萬人患有腦卒中，約有110 萬人死亡[2]，這已成為中國人民主要死因，而缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)占其80%左右[3]。目前缺血性腦卒中患者，能在短時間內迅速恢復腦血流，挽救缺血半暗帶的有效治療方法是超急性期溶栓與血管介入治療，但由于其時間窗極短與禁忌證較多，能在臨床運用并使患者收益相當少，導致IS 患者往往具有很高的殘疾率和死亡率。因此尋找IS早期診斷、判斷預后的新的標記物和新的治療方法已成為神經科學領域的研究熱點之一。越來越多研究表明：血小板微粒(platelet microparticle，PMP)不僅有望成為判斷IS嚴重程度及預后新的標志物，而且有望為IS患者治療方面提供新的治療思路。

1 血小板微粒概述

血小板微粒首次被發現是在1967年，當時發現者沃爾夫將它們命名為“血小板塵埃”[4]。經后面研究表明，血小板微粒是血小板在應激后通過血小板激活和自身凋亡兩條途徑釋放的直徑在0.1～1.0 um的顆粒樣物質[5]。血小板微粒是循環微粒中含量最豐富的微粒，占70%～90%[6]。血小板微粒釋放受高剪切力[7]、ADP、細胞因子、低溫、凝血酶[8]、膠原[9]、Ca2+[10]、補體[11]等影響。有研究通過對比不同血小板激動劑作用下產生的血小板微粒，經過蛋白組學檢測顯示，PMP 中的蛋白質組成與用于血小板刺激的激動劑類型直接相關[12]。

目前PMP的形成和釋放機制研究尚未明確，普遍認為血小板活化時，通過細胞膜信號轉導、鈣通道開放、鈣離子動員和細胞內鈣濃度升高，蛋白質磷酸化，細胞骨架被破壞，這些機制與PMP形成與釋放關系密切。當血小板被激活時，細胞內鈣濃度增加，位于細胞骨架中的肌球蛋白形成細絲，然后從細胞的外圍收縮到中心，而位于膜骨架的肌動蛋白微絲由于受依賴凝Ca2+膠蛋白切割，使其聚合受阻。當活化血小板收縮時，部分缺乏正常膜骨架支持的細胞膜不能正常收縮，向外伸展變形形成偽足，而正常膜骨架支撐部分向內收縮，偽足末端具有芽狀凸起。最后這些活化血小板形成的變形細胞膜可以通過偽足破裂或芽狀突起出芽形成PMP。

有研究發現，在無傳統鈣蛋白酶激活的情況下，靜息血小板形成可通過整合素αIIbβ3信號傳導引起肌動蛋白細胞骨架的去穩定化。這種由整合素介導的肌動蛋白細胞骨架的不穩定而導致PMP的形成，這種不依賴Ca2+的傳統模式，可能是血小板凋亡有關[13]。血小板凋亡可釋放PMP，而導致血小板凋亡機制有兩種，一是由細胞表面死亡受體(腫瘤壞死因子受體等)誘發，經過受體與配體相互作用，傳導信息，引起半胱天冬酶原自身切割，最后導致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶活化，促使血小板凋亡[14]，這是外源途徑。二是線粒體受細胞內信號刺激，使其內膜去極化，打開通透性轉換孔，膜間隙釋放細胞色素C，最后由凋亡執行蛋白誘導血小板凋亡，這是內源性途徑。

2 PMP在IS中的病理生理機制

2.1 PMP與炎性反應 目前PMP參與炎癥反應機制仍未明確，普遍認為內皮細胞、單核細胞可以被PMP活化，并促進兩者相互作用。而活化單核細胞可通過分泌多種促炎因子如腫瘤壞死因子-α、黏附分子、蛋白水解酶、白細胞介素-1β等，使內皮細胞受損，誘導腦內皮細胞黏附分子表達，損害血-腦脊液屏障。中性粒細胞通過受損的血-腦脊液屏障，在缺血性腦組織黏附聚集，通過產生蛋白分解酶和氧自由基，調節炎癥反應，使腦組織受損。然而有人提出PMP可能通過穩定Treg表型，調節炎癥反應從而在組織修復過程發揮作用[15]。調節性T細胞(Tregs)與人體自身免疫息息相關。當Tregs受外來刺激后可自身調節可表現出對促炎癥表型的可塑性，進一步分泌白細胞介素-17(IL-17)或干擾素-γ(IFN-γ)。Tregs 表型是否穩定與炎癥反應是否持續密切相關，當其失衡時可引起移植物抗宿主病。PMP 能通過與CCR6 +HLA-DR+記憶樣Treg亞群、P-選擇素、CXCR3結合成劑量依賴性抑制外周血衍生的Tregs 分化為產生IL-17和IFN-γ的細胞，穩定Treg表型，抑制炎癥反應，縮短炎癥持續時間，從而可能促進腦組織恢復。

2.2 PMP 與血栓形成 血小板微粒促進血栓形成主要機制有以下三個方面，一是血小板活化因子(PAF)方面，PAF是血小板激活劑[16]。當PAF濃度達到一定水平時，就易誘發血栓形成，而PMP 決定了PAF的活性。二是PMP 膜富含PS，當血小板活化時促進血小板聚集和凝血反應，同時它可以通過釋放PMP表達PS 或TF，導致更多凝血酶釋放，使凝血反應加強。這是一種類似于正反饋機制，通過這正反饋加強凝血反應，最終導致血小板進一步減少和血液高凝狀態形成[17]。這種正反饋作用在臨床多種疾病血栓形成中起重要作用，進一步剖析該途徑，研究拮抗劑或許能成為新一代的抗栓藥物。有研究通過對比PMP 與活化后血小板單位表面積在促凝血方面活性發現，PMP促凝血活性遠遠高于活化血小板，最高可達到活化血小板的100 倍[18]。三是Ⅷ因子和Va 因子，Ⅷ因子是Tenase 酶復物形成的協同因子；而凝血酶原酶復合物形成取決于因子Va與Xa結合。雖然Ⅷ因子與血小板的聯系不穩定，但Ⅷ因子及Va 因子結合到PMP 的表面時是穩定的，因此PMP在這方面不依賴于血小板活化促進凝血，這種促凝血活性比血小板活化引起的凝血更持久。據報道SPMP(直徑小于0.5 μm 的血小板微粒)可觸發血小板和單核細胞功能，并通過P-選擇蛋白調節血栓形成[19]。

2.3 PMP 與血管新生 PMP 促進血管新生主要是因為PMP 包含多種血管生成mRNA 及多種原型血管生成蛋白，例如表皮生長因子、血小板衍生生長因子-α、成纖維細胞生長因子(FGF-2)、血管內皮生長因子、內皮糖蛋白、內皮素-1、五聚蛋白-3、血小板因子-4、纖溶酶原激活物抑制劑-1、血管生成素-1、組織金屬蛋白酶-1 和血小板反應蛋白-1 的抑制劑[20]。從而促進血管生成。有研究發現，PMP 可將微RNA(miRNA)傳遞至受體細胞，改變了人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中血管生成調節劑的釋放，還可以抑制血小板反應蛋白-1的生成[21]，從而調節血管形成。此外還有研究發現，PMP 可以通過促進低氧誘導因子-1α細胞分泌血管內皮生長因子，從而促進血管新生[22]。動物實驗表明，大鼠大腦中動脈閉塞實驗模型中，PMP可導致梗死邊緣區細胞增殖、血管生成呈劑量依賴性增加，行為缺陷明顯改善[23]。而在后肢缺血的嚙齒動物模型中，靜脈注射PMP也可促進新血管形成[24]。

3 PMP有望成為IS早期診斷與預測預后的標志物

CHEN 等[25]發現，外周血中檢測PMP，急性缺血性腦卒中(AIS)患者較健康志愿者的PMP 水平顯著升高，而且AIS亞型中循環PMP的水平與梗死體積呈正相關，在小動脈閉塞(LAA)亞型中更明顯。既往也有研究表明，腦梗塞面積與患者良好臨床預后呈負相關，梗塞面積越大，并發癥越多，神經修復能力越低[26-28]。此外，動脈粥樣硬化性腦梗死的PMP水平明顯高于心源性腦梗死[29]。而頸動脈粥樣硬化患者血漿中的PMP水平明顯高于無頸動脈粥樣硬化的健康人。這些研究表明PMP 不僅有助于診斷是否患有缺血性腦卒中及判斷缺血性腦損傷程度，而且在鑒別腦梗塞病因方面也有一定潛力。甚至PMP 在成為動脈粥樣硬化的標志物方面也有巨大前景。

目前AIS 患者最有效治療方法是，在時間窗內靜脈溶栓與血管內治療。對決定是否進一步血管內治療取決于靜脈溶栓是否再通情況，在短短的治療時間窗內，快速、簡捷的判斷再通情況的標志物尤為重要。BIVARD等[30]納入57例診斷為急性腦梗塞并在溶栓時間窗內患者，在接受靜脈內rtPA治療后局部或完全再通的缺血性卒中患者與再通狀況較差的患者相比，PMP 的水平顯著增加，因此PMP 可能是再灌注治療有效性的生物標志物。而再通是臨床預后的有力預測指標，PMP的水平不僅有望成為預測溶栓患者預后指標，而且有望成為靜脈內治療的再通標記為溶栓患者是否分流至血管內治療臨床提供有效的指導。

目前有研究通過納入42 例癥狀性頸動脈疾病患者和31例健康人對照，探討了癥狀性頸動脈疾病患者PMP水平與后續復發栓塞事件標志物之間的關系，發現癥狀性頸動脈疾病患者急性腦缺血病變(DWI+)的PMP較對照組升高，而癥狀性頸動脈疾病患者中急性腦缺血病變(影像學DWI+)較(影像學DWI-)患者PMP明顯升高[31]。該研究與既往研究PMP 與近期腦缺血事件具有相關性結果相符。值得注意的是，經顱多普勒超聲(微栓塞信號)是提示正在進行血栓栓塞活動，而此實驗中經顱多普勒超聲(微栓塞信號[MES+])患者較微栓塞信號[MES-]患者PMP 也明顯升高，PMP與正在進行血栓栓塞活動相關。此研究表明PMP 可以預測正在進行的血栓栓塞活動。

4 PMP與缺血性腦卒中的治療

4.1 PMP 有望成為缺血性腦卒中新的治療方法 通過健康志愿者中收集獲得PMP，予以不同濃度PMP浸潤缺血性腦梗塞模型大鼠腦表面，通過追蹤大鼠腦卒中后90 d 內，神經功能缺損評定、免疫組織化學等檢測發現，外源性PMP處理后的大鼠較未處理大鼠梗塞邊界血管、新生細胞數量明顯增加，殘疾評分下降更明顯[23]。PMP 在體內以劑量依賴的方式增加血管生成和神經發生，并改善中風后的功能結局。或許在重癥腦梗塞，如大面積腦梗塞，尤其是去顱瓣減壓患者方面，可予以外源性PMP 浸潤，促進IS 患者血管新生、神經干細胞分化，促進患者神經功能缺損癥狀改善，這或許有望成為缺血性腦卒中治療新方法，當然目前研究較少，PMP對缺血性腦卒中恢復期作用還需更多證據，運用于臨床還有很長一段路要走。

4.2 抗血小板治療與PMP釋放

4.2.1 不可逆的環氧合酶抑制劑 抗血小板藥對于血管疾病的預防和治療尤為重要，但是它們對PMP釋放的影響及機制目前尚未明確。乙酰水楊酸，也稱為阿司匹林，是一種環氧酶抑制劑。目前關于PMP對乙酰水楊酸(ASA)治療的反應性的報道是有限且矛盾的。既往研究發現，ASA 可降低健康受試者[22]、高血壓心臟病、非重度(＜50%管腔狹窄)冠狀動脈疾病的患者的PMP產生[33]。在心肌梗塞模型大鼠實驗中，ASA也可降低PMP 水平。同時相對于單用ASA 相比，雙抗(ASA 聯合氯吡格雷)效果更為明顯。盡管如此，絕大多數報告表明ASA 對PMP 形成的影響有限。ASA對IS 的急性期或慢性期患者、房顫、周圍動脈閉塞性疾病、高脂血癥患者、多發性梗塞性癡呆癥患者、急性冠脈綜合征、1 型或者2 型糖尿病患者PMP 的釋放均無明顯影響[34-40]。這些矛盾的實驗報道可能是ASA不同治療時間、ASA劑量、PMP定量方法等不同引起，現需進一步規范化及大樣本研究證明。有必要進一步研究不同劑量下ASA 或聯合抗血小板治療能否減少PMP釋放。

4.2.2 腺苷二磷酸受體抑制劑 P2Y12 ADP 受體通過與Gi 蛋白和腺苷酸環化酶途徑偶聯，相互作用，促進纖維蛋白原的GP IIb/IIIa受體激活，這在PMP形成中起重要作用[41]。P2Y12受體拮抗劑通過增加環內單磷酸腺苷的血小板內濃度，降低血小板激活敏感度和隨后的血小板囊泡化。有研究發現急性冠狀動脈綜合征患者在發病24 h內[42]，予以氯吡格雷治療，通過檢測用藥前后循環PMP表達水平發現，PMP在服藥后下降，其中以持續用藥第5 天最為明顯。FRAN?A等[43]也發現，穩定的冠心病患者氯吡格雷血漿濃度與PMP 釋放量成負相關。PMP 或許可以成為評估藥物抗血小板效果的潛在標志物。

4.2.3 HMG-CoA 還原酶抑制劑(他汀類) 血小板活化和聚集能促進凝血反應和血栓形成。據此，通過抑制血小板活化，啟動IS一級預防，或許是預防IS的有效方法。有研究發現HMG-CoA還原酶抑制劑，不僅可以通過降低膽固醇，減少動脈粥樣硬化事件[44]。同時可以預防內膜增生及血小板的活化和聚集。參與細胞骨架重組的修飾G 蛋白功能和Rho 激酶途徑，他汀類藥物會影響PMP脫落，以脂質非依賴性方式降低PMP的數量[45-46]。HMG-CoA 還原酶抑制劑有助于降低NF-KB活性，并促進過氧化物酶體增殖物激活受體暴露。因此，它們影響許多促炎細胞因子和趨化因子的釋放[47]，從而限制了血小板的活化。ROSA等[45]研究結果也相同，與未經治療的血漿脂質水平相同的患者相比，他汀類治療的高膽固醇血癥患者的PMP濃度較低。缺血性腦卒中后高脂血癥患者予以辛伐他汀20 mg/d，維持6個月，患者PMP百分比降低[48]。

4.2.4 維生素K 拮抗劑 CHOUDHURY 等[49]通過對房顫(AF)患者治療研究，發現以前未進行過任何抗栓治療，華法林開始口服抗凝治療(國際標準化比例的目標范圍在2～3)對PMP 釋放沒有顯著影響，而且，在接受ASA 和華法林的AF 患者中，PMP 濃度無顯著差異。既往規律服用ASA 的AF 患者改為服用華法林一段時間對比，PMP釋放也沒有明顯變化。

5 展望

綜上所述，PMP 具有多種特性，在缺血性腦卒中中參與多種病理機制，PMP 在成為缺血性腦卒中診斷、預后的標志物，提供新的治療思路具有巨大潛力。研究人員已開始將PMP視為血管疾病(尤其是腦血管疾病風險分層)中的新型生物標記物。藥物對循環PMP的影響，或許可以為IS治療的提供一個新的治療方向。通過調節PMP釋放，而且暴露其表面標志物可能具有重要的治療作用，同時可能監測抗血小板治療的療效。雖然PMP在缺血性腦卒中的早期診斷、治療及預測預后方面具有廣闊前景，但是距離運用于臨床還有很長一段路要走，還需進一步研究和檢驗。