實時熒光聚合酶鏈式反應技術在慢性乙型肝炎患者血清標本HBV DNA定量檢測中的應用價值

張寧

(南陽市第二人民醫院 檢驗科，河南 南陽 473000)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是常見傳染性疾病之一。據統計，CHB每年致100萬人死亡[1]。因此，臨床需加強CHB早期篩查，并動態監測病情變化，以針對性干預治療，抑制病情進展。肝活檢是臨床診斷和評估肝臟疾病的金標準，但其為介入性操作，存在一定創傷，可重復性差。HBV DNA能直接、客觀地反映HBV感染、復制活性，而熒光聚合酶鏈式反應(fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技術在密閉環境內進行，無需電泳，借助計算機自動定量分析，操作簡單，且能避免標本污染。研究表明，在血液篩查中，FQ-PCR技術能提高HBsAg陰性低濃度HBV感染者的檢出率[2]。本研究旨在探討實時FQ-PCR技術在CHB患者血清標本HBV DNA定量檢測中的應用價值，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年4月至2018年6月南陽市第二人民醫院收治的109例CHB患者作為研究組，同期81例HBV早期感染者作為對照組。研究組：男71例，女38例，年齡26～57歲，平均(41.48±6.13)歲，體質量指數18.4～26.8 kg·m-2，平均(22.71±1.35)kg·m-2。對照組：男52例，女29例，年齡24～59歲，平均(42.08±5.97)歲，體質量指數18.2～26.7 kg·m-2，平均(22.69±1.29)kg·m-2。兩組年齡、性別、體質量指數差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 納入及排除標準(1)納入標準：①初次確診；②入組前6個月內未經抗HBV治療；③簽署同意書。(2)排除標準：①丙型、甲型等其他類型肝炎；②自身免疫性疾病。

1.3 治療方法指導合理飲食、規律生活、適宜運動，拉米夫定(中孚藥業股份有限公司，國藥準字H20133056)，口服，每次300 mg，每日1次。

1.4 檢測方法

1.4.1HBV DNA 以實時FQ-PCR技術測定HBV DNA。所需試劑盒、試劑由深圳匹基生物工程股份有限公司提供，FQ-PCR檢測儀由美國羅氏公司提供。晨空腹以非抗凝管取靜脈血3 mL，采取PEG沉淀法提取血清樣品，加熱裂解，取提取液2 μL做模板，依次以92 ℃、5 s，60 ℃、30 s，37 ℃、60 s，做40個循環，延伸結束，測F1通道熒光強度，反應結束，采用FQ-PCR檢測儀自帶軟件繪制標準曲線，計算樣品檢測結果。血清HBV DNA陽性：HBV DNA水平≥5×102copies·mL-1。檢測結果采用絕對值的對數值進行比較分析，實驗設臨界值、陰性、強陽性各1孔作為內標對照，同時采取5×107、5×106、5×105、5×104copies·mL-1陽性標準作為外標。

1.4.2HBV DNA變異 向PCR反應混合液內加熒光標記寡核苷酸探針，以熒光循環技術記錄熒光雜交探針溶解溫度，測HBV DNA變異情況。操作由相同資深專科醫生嚴格按規范完成。

1.5 統計學處理采用SPSS 21.0統計軟件處理數據，計數資料以頻數和率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，等級資料采用Ridit檢驗，計量資料采取Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗與Bartlett方差齊性檢驗，均確認近似服從正態分布且方差齊性，以均數±標準差描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入院首次兩組HBV DNA表達水平入院首次檢測，研究組HBV DNA表達水平為(7.21±1.03)copies·mL-1，對照組HBV DNA表達水平為(3.49±1.28)copies·mL-1。研究組HBV DNA表達水平高于對照組，差異有統計學意義(t=22.184，P<0.001)。

2.2 研究組HBV DNA表達水平治療前HBV DNA表達水平為(7.21±1.03)copies·mL-1，治療后3個月HBV DNA表達水平為(3.49±0.98)copies·mL-1，治療后6個月HBV DNA表達水平為(2.81±0.76)copies·mL-1，治療后9個月HBV DNA表達水平為(2.79±0.80)copies·mL-1。經單因素方差分析，治療后3、6、9個月HBV DNA表達水平對比，差異有統計學意義(F=602.257，P<0.001)；兩兩對比，治療后6、9個月HBV DNA表達水平低于治療后3個月，治療后3個月低于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 研究組HBV DNA變異率治療前研究組HBV DNA變異率為0，治療后3個月研究組HBV DNA變異率為0，治療后6個月為11.93%(13/109)，治療后9個月為20.18%(22/109)，不同時間點比較，差異有統計學意義(F=43.087，P<0.001)。治療后 9個月HBV DNA變異率高于治療后6個月，治療后6個月高于治療后3個月、治療前，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

我國屬于CHB高發地區，全國約1.3億HBV攜帶者，其中3 000萬以上為需積極治療現癥感染者。HBV感染后表現復雜，單純血清標志物檢測難以準確評估病毒復制活性，而外周血HBV DNA是病毒感染后復制最可靠、最直接的指標，但常規PCR法操作復雜，污染物多，假陽性率較高，致使HBV DNA檢測臨床應用受限[3-4]。

FQ-PCR是近年發展起來的一種新型PCR技術，其融合分子雜交、基因擴增、熒光物理技術于一個整體，在封閉條件下實施基因擴增、產物分析，同時借助微機控制實現自動分析及實時監測，可補充常規PCR技術無法定量、易污染等弊端[5]。研究顯示，FQ-PCR法檢測HBV DNA能真實反映HBV感染及復制狀態，對CHB臨床診斷、治療方案制定、預后評估具有重要指導意義[6]。本研究顯示，入院首次檢測研究組HBV DNA表達水平高于對照組，與上述研究結論近似。此外，本研究采取FQ-PCR技術動態監測CHB患者治療前、治療中HBV DNA表達水平，結果顯示，治療后6、9個月HBV DNA表達水平低于治療后3個月，治療后3個月低于治療前，提示系統性治療中FQ-PCR技術可實時反映病毒復制活性，可為臨床預后評估提供參考依據。有研究報道，CHB患者經系統治療6個月以后，外周血HBV DNA表達水平未繼續降低，甚至有再次升高情況[7-8]。這與本研究拉米夫定治療6、9個月后血清HBV DNA水平無變化的結果一致。拉米夫定是一種新型強效抑制HBV復制核苷類藥物，具有服用方便、耐受性好等特點，相關研究表明，抗病毒治療中HBV會激活自身免疫逃逸機制，酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天門冬氨酸基因序列出現突變，對抗機體免疫攻擊行為，出現耐藥性，一旦出現耐藥性，拉米夫定不再敏感，可能會伴肝功能異常、HBV DNA定量反跳等情況[9-11]。因此，臨床在準確評估HBV DNA復制活性的同時還需積極了解HBV變異性。本研究進一步對比發現，治療后9個月HBV DNA變異率高于治療后6個月，治療后6個月高于治療后3個月、治療前，由此可知，隨著治療周期的延長，HBV DNA變異率呈升高趨勢，實時FQ-PCR技術能同時了解HBV DNA變異性，對臨床合理用藥，調整治療方案和進一步提高治療效果具有積極意義。

綜上可知，實時FQ-PCR技術檢測血清標本HBV DNA水平可客觀反映HBV感染、復制活性，可為臨床診斷、療效評估提供數據支持。