土壤中二苯砷酸的吸附解吸、結合形態(tài)與代謝轉化研究進展

涂晨，路露露, ，朱濛，韋婧，劉穎，駱永明,

1. 中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室/中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003；2. 北京化工大學資源與環(huán)境研究中心，北京 100029；3. 安徽師范大學環(huán)境科學與工程學院，安徽 蕪湖 241002；4. 中國科學院土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室/中國科學院南京土壤研究所，江蘇 南京 210008

在第一次和第二次世界大戰(zhàn)期間，苯砷類化學武器被大規(guī)模制造和使用。其中，苯砷類化合物二苯氰砷（Diphenylcyanoarsine，DA）和二苯氯砷（Diphenylchloroarsine，DC）因具有強烈刺激性，是毒氣彈——“紅劑”的主要成分（何躍忠等，2005），并在戰(zhàn)爭中作為嘔吐劑和糜爛劑使用。戰(zhàn)后，大批遺棄的化學武器僅通過陸地掩埋或海洋傾倒的方式進行了簡單的處置。掩埋于土壤深處的化學武器經長期腐蝕，其內部有毒有害物質發(fā)生泄漏。這些有機砷化物在土壤、地下水及沉積物中經水解或氧化，形成結構更加穩(wěn)定的二苯砷酸（Dipenylarsinic acid，DPAA）和苯砷酸（Penylarsonic acid，PAA）等物質，并對周邊環(huán)境造成污染（Ochi et al.，2004）。DPAA在環(huán)境中的存留時間較長，且具有很強的細胞毒性與基因毒性（Yamaguchi et al.，2017）。2002年，日本卡米蘇地區(qū)首次在受化學武器泄漏所污染的地下水中發(fā)現(xiàn)砷的主要存在形態(tài)為DPAA，其最高濃度超過飲用水砷含量標準的450倍（Nakamiya et al.，2007）。當?shù)鼐用裼捎陲嬘檬芪廴镜木畬е铝藝乐氐闹袠猩窠浵到y(tǒng)疾病，表現(xiàn)為腦萎縮、行走困難、視覺障礙、失眠和記憶力下降（Ishizaki et al.，2005；Ishii et al.，2004）。中國東北某受日遺化學武器污染的土壤檢出總砷濃度最達2967 mg·kg-1，其中2-氯乙烯砷酸和芳香砷化物（包括DPAA、PAA和三苯砷等）是該污染區(qū)土壤中最主要的兩類砷化物（周黎明等，2008）。Baba et al.（2008）從受芳香砷污染的土壤中檢測到 DPAA、PAA、甲基化苯砷酸（Methylphenylarsinic acid，MPAA）等多種有機砷和無機砷化合物。Arao et al.（2009）進一步通過室內水培和盆栽實驗，發(fā)現(xiàn)相較于二甲基苯砷、甲基二苯砷等芳香砷污染物，土壤中DPAA和MPAA更容易被水稻根部吸收并遷移至籽粒。上述研究表明，DPAA在土壤中具有較強的遷移性和生物有效性，并可通過食物鏈富集傳遞，進而引發(fā)人體健康風險（Gorecki et al.，2017）。

土壤是包含多介質、多界面的生命與非生命復合系統(tǒng)，作為土壤中的重要活性膠體組分，微生物在很大程度上決定了土壤中無機和有機砷化物的環(huán)境行為、生物有效性與生物降解潛力。因此，研究微生物介導下砷（有機砷與無機砷）在土壤中的氧化與還原、結合與釋放以及轉化與降解等化學與生物學過程的耦合機制，探索砷污染土壤的生物修復技術，不僅是國際環(huán)境科學與土壤修復領域的研究熱點，更是中國乃至全球所亟需解決的重大環(huán)境問題，對保障糧食安全、人體健康和人居安全都具有十分重要的理論與現(xiàn)實意義。本文綜述了土壤中DPAA的吸附與解吸特征、DPAA在土壤鐵氧化物和膠體顆粒表面的結合形態(tài)與分子鍵合機制，以及微生物對DPAA的好氧降解與厭氧代謝轉化途徑與機制，探討了硫酸鹽還原菌參與下土壤中DPAA的厭氧生物轉化與硫酸鹽還原、鐵還原等化學過程之間的耦合機理，旨在為中國化學武器埋藏區(qū)有機砷污染土壤的生物修復提供理論依據與技術支撐。

1 DPAA在土壤中的吸附解吸特征及其影響因素

砷在土壤中的吸附較復雜，主要吸附在土壤顆粒表面，包括黏土、金屬（鐵、鋁、錳）礦物、碳酸鈣或有機質，其吸附機制主要包括水解、陽離子配位、同晶置換等（胡立剛等，2009；謝正苗等，1998）。土壤中的含鐵礦物（如鐵氧化物/氫氧化物）對砷的吸附與固持具有重要的作用，鐵的還原作用以及由鐵還原導致的載砷礦物賦存形態(tài)與組成結構的變化都將嚴重影響砷在土壤中結合-釋放的動態(tài)再分配過程（楊明等，2013）。然而，關于有機砷化物在土壤中環(huán)境行為的研究非常有限，主要集中在對獸藥洛克沙砷吸附-解吸特征的研究（Brown et al.，2005；張雨梅等，2007），鮮有關于DPAA在土壤中吸附-解吸特征及其影響因素的報道。Wang et al.（2013）比較了DPAA在兩種理化性質差異較大的典型土壤——黑土（Phaeozem）和紅壤（Acrisol）中的吸附與解吸特征，發(fā)現(xiàn)與無機砷酸鹽及分子量較小的有機砷相比，土壤對于DPAA的吸附能力相對較弱，且解吸率也較高，表明DPAA在土壤中具有極強的遷移性。DPAA在紅壤表面的吸附量要遠高于在黑土中，且二者吸附等溫線均可用Freundlich方程和Henry方程擬合。DPAA在兩種土壤中解吸量與吸附量呈線性關系，紅壤對DPAA的固定能力要高于黑土。朱濛（2017）比較了DPAA在 13種理化性質差異明顯的土壤中的吸附特性，發(fā)現(xiàn)鐵氧化物含量高的土壤（如酸性硫酸鹽土、水稻土、火山灰土、紅壤和赤紅壤）對DPAA的吸附能力強于鐵氧化物含量低的土壤（如棕壤、潮土和黑土）。

已有研究表明，DPAA在土壤中的吸附解吸特征受到土壤pH、競爭離子如磷酸鹽、鹽度、氧化物及有機質等環(huán)境因子的影響。Wang et al.（2013）比較了初始pH、PO43-及離子強度對土壤中DPAA吸附的影響，發(fā)現(xiàn)DPAA在土壤中的吸附量隨pH增加顯著降低，背景溶液的離子強度對DPAA吸附的影響較小，而競爭離子 PO43-可顯著抑制紅壤中DPAA的吸附量，但對黑土的抑制作用不顯著。Zhu et al.（2016）發(fā)現(xiàn)，土壤對DPAA的吸附常數(shù)Kf整體上表現(xiàn)出隨鹽度增加而增加的趨勢，這可能與鹽析效應有關。氧化物和有機質也是影響土壤中DPAA吸附的重要因素（Wang et al.，2013，朱濛等，2018）。朱濛（2017）比較了原土及分別去除晶質和非晶質氧化物以及有機質后的土壤對DPAA的吸附能力，發(fā)現(xiàn)與原土相比，去晶質和非晶質氧化物顯著降低了土壤對DPAA的吸附能力，說明晶質和非晶質氧化物提供了 DPAA在土壤中的主要吸附位點。與去氧化物的處理相比，去有機質對吸附常數(shù)Kf的影響最小，且與土壤類型密切相關。這是因為DPAA在土壤中的吸附主要受氧化物的配位交換作用而非有機質的疏水作用控制，這與無機砷、洛克沙砷和阿散酸的吸附機制類似。此外，土壤中廣泛存在的可溶性有機質（Dissolved Organic Matter，DOM）也可影響有機/無機砷化合物在土壤表面的吸附效果，其作用機制包括：（1）DOM可能同土壤中金屬水合氧化物發(fā)生絡合反應，屏蔽有機砷的吸附位點（Bauer et al.，2006；Chen et al.，2012；Redman et al.，2002）；（2）DOM能增加土壤中金屬氧化物礦物的溶解（Harvey et al.，2002）。

微生物的氧化還原作用是調控土壤中無機砷固定與釋放的重要因素（Islam et al.，2004；Campbell et al.，2006；羅婷等，2011；王亞潔等，2015），然而，微生物介導的氧化還原作用及DPAA在土壤（鐵氧化物表面）的結合與釋放研究罕見報道。Zhu et al.，（2016）率先研究發(fā)現(xiàn)，向淹水土壤中添加乳酸鈉可刺激土壤中土著微生物的活性，促進土壤中的硫酸鹽還原和鐵還原，進而促進了DPAA從土壤固相向土壤溶液的釋放。涂晨等（2019）則進一步從該淹水土壤中分離純化獲得一株硫酸鹽還原菌Clostridium sp. SRB-2，并比較研究了菌株SRB-2介導下DPAA在不同類型合成鐵氧化物及不同類型土壤中的吸附-解吸特征，但具體機制仍有待深入研究。

2 DPAA在土壤顆粒及鐵氧化物表面的結合形態(tài)與分子鍵合機制

大量研究表明，砷在環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)中的效應并不僅取決于其總量，而是取決于其賦存形態(tài)。真實客觀地揭示砷在土壤顆粒中的結合形態(tài)及其結合機制，有助于準確預測環(huán)境中砷的生物有效性、毒性及其環(huán)境遷移風險。目前，研究砷在土壤中結合形態(tài)的方法主要是連續(xù)分級提取法（Dousova et al.，2008），該方法通過采用不同強度的化學試劑，破壞特定的土壤組分從而進行元素形態(tài)的測定，所獲得的結果可以反映目標元素在土壤中的結合方式以及結合的強弱程度。本研究組前期采用連續(xù)分級提取法研究了DPAA在土壤礦質膠體中的結合形態(tài)與含量，結果表明：土壤礦質膠體中非專性吸附態(tài)DPAA的比例較高（8.2%—46.7%），這部分DPAA主要通過靜電引力吸附到土壤礦質膠體表面，僅生成外圈層絡合物，很容易被 SO42-等陰離子置換進入土壤溶液，在砷的所有結合形態(tài)中遷移能力最強；專性吸附態(tài)是DPAA在土壤礦質膠體中的另一種重要結合形態(tài)，占 DPAA吸附總量的 19.5%—47.4%，這部分DPAA通過生成內圈層表面絡合物吸附到土壤礦質膠體表面，很容易通過施加磷酸鹽釋放出來；與專性吸附態(tài)（表面絡合）相比，土壤礦質膠體上的無定形氧化物結合態(tài)、弱晶質氧化物結合態(tài)和晶質氧化物結合態(tài)DPAA可以嵌入到氧化物顆粒內部的孔隙中并發(fā)生絡合和/或沉淀作用，與土壤礦質膠體的結合能力更強，通常情況下很難解吸進入土壤溶液。然而，連續(xù)分級提取法仍存在很多缺陷，包括：提取步驟麻煩、試劑的選擇性有限和已釋放的重（類）金屬在各形態(tài)間再分配等（朱濛，2017）。

基于同步輻射的 X-射線吸收光譜（Xiderowg Action System，XAS）技術是一種新型原位光譜分析手段，包括 X射線吸收近邊結構（X-ray Absorption Near Edge Structure，XANES）和擴展邊X射線吸收精細結構（X-Ray Absorption Fine Structure，EXAFS）分析，能夠滿足原位測定、價態(tài)分析和結構表征等測定要求。近年來，該技術在土壤科學中的應用發(fā)展十分迅速。Luo et al.（2006）對砷在紅壤表面吸附的微觀配位結構進行了研究，認為砷主要與土壤中的鐵和鋁形成內圈層雙齒雙核配合物，其As-Fe間距為3.28 ?，As-Al間距為3.17 ?。Thomasarrigo et al.（2014）采用穆斯堡爾譜和 X射線同步輻射技術揭示了來自河床的有機絮體中，As(V)和 As(III)都是以單齒雙核配合物的形式與絮體中的三價鐵氧化物形成“橋”形連接，其As-Fe間距為3.31—3.34 ?。李士杏等（2011）運用EXAFS分析發(fā)現(xiàn)，無機砷在紅壤中吸附的微觀機制為鐵氧化物形成內圈層雙齒雙核配合物，As-Fe鍵的原子間距為3.09—3.25 ?。然而，關于DPAA在土壤礦物或土壤顆粒表面結合形態(tài)與微觀機制的研究仍非常有限。

Tanaka et al.（2014）采用EXAFS技術揭示了DPAA和 PAA在水鐵礦表面的結合機制為雙齒雙核配合物與單齒配合物共存。本研究組前期利用上海同步輻射光源，初步揭示了DPAA與多種鐵氧化物以及土壤顆粒的結合形態(tài)與分子機制。XANES結果表明，DPAA在針鐵礦、赤鐵礦和菱鐵礦表面可同時生成內圈層雙齒雙核絡合物和外圈層絡合物；而在水鐵礦和磁鐵礦表面僅生成內圈層雙齒雙核絡合物和少量外圈層絡合物。DPAA在不同鐵礦物表面形成的 As-Fe鍵原子間距為 3.19—3.33 ?（Zhu et al.，2019）。上述研究表明，DPAA可通過靜電吸引、氫鍵、表面絡合、嵌入礦物顆粒內的絡合作用等機制與鐵礦物相互作用。

此外，朱濛（2017）采用掃描透射X射線顯微成像（Scanning Transmission X-ray Microscope，STXM）技術研究了土壤中的土著SRB富集混懸菌液對DPAA在針鐵礦表面的吸附解吸與分子鍵合特征的影響。結果表明，添加SRB富集混懸菌液可顯著增加針鐵礦表面Fe(II)和As元素的面密度，提示SRB混懸菌液促進了針鐵礦的還原性溶解和DPAA的釋放。研究結果可為進一步揭示純菌介導的鐵還原條件下，DPAA在土壤礦物表面的結合與釋放動態(tài)機理提供科學依據與方法學基礎。

3 土壤中 DPAA的好氧微生物降解與厭氧微生物代謝轉化機制

大量研究表明，微生物對砷的代謝轉化過程在砷的地球化學循環(huán)中起到了十分重要的作用，國內也已有多名學者綜述了微生物對無機砷的代謝轉化作用機制（Dhuldhaj et al.，2013；Hudson-Edwards et al.，2013；Jia et al.，2014；陳倩等，2011；吳佳等，2011；王革嬌等，2014；楊婧等，2009；朱永官，2013）。Li et al.，（2019）通過厭氧培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，加入硝酸鹽可大幅提高微生物驅動的三價砷氧化速率，而硝酸鹽還原速率不受三價砷影響。但目前有關利用微生物降解轉化有機砷污染物的研究仍非常有限。K?hler et al.（2001）在2001年從受化學武器泄漏物而嚴重污染的土壤中篩選出具有降解三苯砷及其氧化物的4種微生物，這些微生物均能將有機砷降解成無機砷，這是國際上首次關于微生物降解芳香砷的報道。隨后，Nakamiya et al.（2007）揭示了棲息微球菌（Kytococcus sedentarius）NK0508對DPAA的好氧降解代謝產物包括砷酸鹽和甲基化二苯砷（Diphenylmethylarsine oxide，DPMAO）。Harada et al.（2010）發(fā)現(xiàn)劍菌屬Ensifer adhaerens菌株可通過體內的單加氧酶實現(xiàn)對對DPAA的好氧降解，其降解代謝產物包括單羥基化DPAA、PAA和砷酸鹽。最近，宋芳等（2017）通過對一株重金屬耐性菌紫金牛葉桿菌RC6b進行化學誘變，顯著提高了該菌對DPAA的好氧降解能力，并鑒定出誘變菌對DPAA的好氧降解代謝產物為單羥基化DPAA，但DPAA的脫苯環(huán)產物PAA以及無機砷酸鹽卻未檢出。

除了好氧微生物對DPAA的降解代謝，許多厭氧微生物也參與了 DPAA的代謝轉化。Arao et al.（2009）發(fā)現(xiàn) DPAA在厭氧環(huán)境下能被土壤微生物脫苯環(huán)代謝轉化為 PAA，并進一步形成無機砷酸鹽。Guan et al.（2012）研究發(fā)現(xiàn)，向厭氧土壤中加入硫酸鹽和碳源，可顯著提高土壤中DPAA的降解速率，土壤中的DPAA可在3—5周內被徹底轉化，其轉化產物中既包含在能好氧降解途徑中產生的PAA和砷酸鹽，也包括 DPAA的甲基化產物——DPMAO，以及一種尚不明確的新型含硫有機砷化物。Hisatomi et al.（2013）進一步采用液相色譜-飛行時間質譜將該未知化合物鑒定為二苯基硫代砷酸（Diphenylthioarsinic acid，DPTAA）。朱濛（2017）采用三重四極桿-液質聯(lián)用儀分析了淹水條件下DPAA在黑土中的消減動態(tài)和轉化產物，研究結果發(fā)現(xiàn)：在外源添加碳、硫條件下，土壤中的DPAA濃度隨培養(yǎng)時間延長而顯著降低，同時在土壤浸提液中檢出了DPAA的硫化產物DPTAA。這一結果表明，土壤中的厭氧微生物（特別是硫酸鹽還原菌）對DPAA的厭氧代謝轉化發(fā)揮著重要作用，但具體機制尚不清楚。圖1總結了土壤中DPAA的形成過程及其在好氧和厭氧環(huán)境下的微生物代謝轉化路徑。

圖1 土壤中DPAA的形成過程及其在好氧和厭氧環(huán)境下的微生物代謝轉化路徑Fig. 1 The formation process of DPAA in soil and its microbial metabolic transformation pathway in aerobic and anaerobic environments

近年來，有關有機污染物的厭氧降解耦合鐵循環(huán)及硫酸鹽還原的機制正成為國際上的研究熱點與難點（Luo et al.，2013；Tian et al.，2015；胡敏等，2014）。Flynn et al.（2014），首次報道了一株兼性厭氧鐵還原菌Shewanella oneidensis MR-1可在堿性條件下優(yōu)先介導硫還原，并進一步將Fe(III)直接還原為 Fe(II)，進而實現(xiàn)微生物介導的硫還原與非生物介導的鐵還原過程相偶聯(lián)。而汪明霞等（2014）的研究則表明，Shewanella oneidensis MR-1在異化還原 Fe(III)的同時，F(xiàn)e(III)可將 As(III) 氧化為As(V)，提高砷在鐵礦物表面的吸附能力，進而降低環(huán)境中砷的移動性和毒性。在厭氧條件下，土壤中的硫酸鹽還原菌可利用硫酸鹽作為電子受體氧化小分子有機酸，釋放出硫化氫，硫化氫與DPAA加成，中間產物經進一步脫水生成 DPTAA（Guan et al.，2015，Zhu et al.，2016）。涂晨等（2019）從厭氧的DPAA污染土壤中分離純化出的一株硫酸鹽還原菌Clostridium sp. SRB-2，該菌具有較強的硫酸鹽還原和鐵還原能力，同時還對土壤中的DPAA具有較強的耐受力和厭氧轉化能力。在厭氧培養(yǎng)2周時，菌株 SRB-2對針鐵礦溶液體系中DPAA的轉化去除率可達41.8%。在接種SRB-2菌株的DPAA-針鐵礦厭氧培養(yǎng)體系中，DPAA的厭氧轉化伴隨著體系中Eh和硫酸鹽的降低。進一步采用STXM技術分析發(fā)現(xiàn)，接種SRB-2菌株的針鐵礦表面Fe(III)發(fā)生了還原性溶解，生成的Fe(II)濃度以及溶液中DPAA的濃度隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，提示厭氧條件下，硫酸鹽還原菌SRB-2介導的硫酸鹽還原、鐵循環(huán)以及DPAA的代謝轉化過程之間的確存在著緊密的聯(lián)系，但其化學與生物學耦合機制尚不明確，仍有待作進一步深入研究。

4 未來研究展望

微生物介導的硫酸鹽還原、鐵還原與污染物在土壤顆粒表面釋放與降解的耦合機制已成為土壤化學與土壤生物學研究領域的重要前沿課題。未來應該加強以下幾個方面的研究：

（1）闡明微生物參與下 DPAA在不同類型土壤-地下水環(huán)境中的賦存形態(tài)與生物有效性；揭示DPAA 在土壤-地下水-微生物-植物系統(tǒng)中遷移轉化過程及其影響因素；服務于DPAA污染土壤-地下水的環(huán)境風險評估。

（2）結合宏基因組、轉錄組、蛋白質組和代謝組學等多組學關聯(lián)分析技術，闡明硫酸鹽還原菌介導的DPAA厭氧代謝轉化過程與硫酸鹽還原、鐵還原等化學過程之間的分子耦合機理，服務于化學武器埋藏區(qū)有機砷污染土壤和地下水環(huán)境的生物修復。