菌渣好氧堆肥過程中腐熟度指標及紅外光譜的動態變化

王艮梅 ，黃松杉 ，王良桂 ，鄭光耀

1. 南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210037；2. 南京林業大學林學院，江蘇 南京 210037；3. 中國林業科學院林產化工研究所，江蘇 南京 210042

中國食用菌產業發展迅速。根據《中國食用菌年鑒》的統計，2000年中國食用菌產量只有664萬噸，到2012年產量已增至2828萬噸，而目前已突破3100萬噸（中國財經網，2015），占全球總產量的70%以上，排名世界第一（蘇安祥，2013）。由此也導致了菌渣廢棄物產生量急驟增加。而中國高度集約化養殖業每年產生的畜禽糞便（鮮重）高達40億噸（閻波杰等，2010），其中雞糞在畜禽糞便中占有較大比例（武晉萍等，2019），如何合理處置這些固體廢棄物成為亟需解決的重要社會和環境問題（王瑩等，2013）。

菌渣中的有機質豐富、養分含量高、容重小、孔隙度大，是極具資源化利用潛力的一種固體廢棄物。而傳統的菌渣處理方式多為丟棄或焚燒，這不僅造成了農業有機資源的浪費，也對周圍的環境造成污染。近些年來，菌渣資源化綜合利用研究受到很多學者的關注（胡曉婧等，2014；孫杰等，2015；Jordan et al.，2008；Herrero-Hernández et al.，2011；Zhang et al.，2014；Lopes et al.，2015；Lou et al.，2015；Karas et al.，2016），涉及的資源化利用方式有：用作飼料、制作有機肥、生產生物農藥、用作生態環境修復材料、代替原生材料栽培食用菌、制造沼氣、用作園藝基質等。在眾多的利用方式中，高溫堆肥處理方式被各國研究者普遍認可（劉超，2018；王義祥，2019；Zhang et al.，2014），在有機質穩定化的同時，還可以降低物料中的有毒有害物質，如重金屬活性、病原物、鹽分等。為保證堆肥產品質量，對堆肥的腐熟度進行評價不可或缺。但由于堆肥原料的多樣性，以及堆肥過程中形成的中間產物的復雜性，堆肥腐熟評價指標和參數尚無統一的標準，因此，對堆肥腐熟度的評價一直是堆肥技術研究中的難點之一。

在已有的大量研究中，通常用物理、化學和生物學參數指示堆肥的腐熟程度（Levanon et al.，2002；Bernal et al.，2009）。單一指標參數難以準確確定堆肥的化學及生物學的穩定性，實際研究中，研究者通常選擇多個指標來評價堆肥的腐熟度，目前高溫發酵堆肥技術評價涉及溫度、水分、C/N、pH、種子發芽指數、養分元素等的研究較多，而在堆肥腐熟過程中對有機物質的結構及成分變化的研究相對較少。現代的傅里葉紅外光譜分析技術能很好地分析有機質的結構變化特征，可作為堆肥腐熟穩定程度評價的理論依據（宋彩紅等，2015）。本研究以食用菌菌渣為主要堆肥材料（主要成分為楊樹木屑、甘蔗渣、玉米芯），豆渣和雞糞為添加材料，在采用常規腐熟度評價指標的基礎上，結合紅外光譜分析，研究堆肥過程中菌渣堆肥理化參數的變化及有機物質結構的動態變化特征，為深入探討菌渣堆肥過程中有機物轉化的內在機理，實現菌渣堆肥的資源化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌渣由綠雅（江蘇）食用菌有限公司提供，為杏鮑菇栽培廢料，其成分主要是楊樹細木屑、甘蔗渣和玉米芯，使用前打碎曬干，供試黃豆渣、雞糞購自市場。供試菌劑購自宜春強微生物科技有限公司。補充氮素的來源為尿素（分析純）。供試材料的基本性質見表1。

1.2 試驗處理設計及實施過程

菌渣堆肥腐熟試驗共設計3個處理，分別為菌渣與黃豆渣混堆（C1），菌渣與雞糞混堆（C2）和菌渣直接堆制（C3），其中菌渣與豆渣、菌渣與雞糞兩種處理的物料在適宜的碳氮比下，按照相同的質量比進行配比，3種處理物料的具體用量為：菌渣42.71 kg+豆渣22.78 kg；菌渣36.32 kg+雞糞19.37 kg；菌渣61.53 kg。

試驗設在東南大學九龍湖校區的試驗場露天空地，采用靜態好氧堆肥技術進行堆制。具體堆制過程如下：將新鮮的菌渣去袋、打碎、曬干，將菌渣與豆渣和雞糞按照事先設定好的比例混勻，同時每個堆體添加適量的微生物菌劑（20 g）和尿素（100 g），同時調節堆體的水分至60%左右，堆制成近1 m高的圓錐形堆體。為保證氧氣供應充足，分別在堆肥開始后的第10、20、30天進行翻堆。每日09：00及17：00用探針式數顯溫度計，插入堆體中部（約40 cm深）進行讀數，隨機選取3點測量溫度，取平均值作為實測溫度，同時用水銀溫度計記錄當天的環境溫度。堆肥開始后第0、3、9、15、21、29、37、43天進行動態采樣，每個堆體按照5點采樣法采集兩袋樣品，一袋采回后立即放入4 ℃冰箱保鮮，用于測定種子發芽指數GI，另一袋采回后風干用于測定堆體pH、電導率、胡敏酸（HA）及富里酸（FA）含量、全C及全N含量，以及分析紅外光譜特性。

1.3 樣品的測定指標及方法

pH和電導率（EC）（GB 7859—1987）：稱取風干樣按固液比1?10，在室溫下振蕩1 h后測定。pH值使用pH計（pHS-3C）測定，EC使用電導率儀（DDS-310）測定。

碳氮比（C/N）測定（鮑士旦，2011）：總碳含量采用重鉻酸鉀外加熱法；總氮含量采用半微量凱氏定氮法。

種子發芽指數（GI）（GB/T 23486—2009）：取5 g堆肥鮮樣于150 mL三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，30 ℃下振蕩24 h后，過濾，吸取5 mL濾液，加到鋪有濾紙的 9 cm培養皿內。每個培養皿點播30粒飽滿的小白菜（Brassica campestrisL. ssp.chinensisMakino）種子，放置在(20±1) ℃培養箱中培養，24 h后測種子發芽指數（GI）。每個處理重復3次，以蒸餾水為對照。發芽指數GI的計算方法：

式中，GI為種子發芽指數；G為堆肥樣品浸提液中種子的發芽率；L為堆肥樣品浸提液中種子的根長；G0為蒸餾水中種子的發芽率；L0為蒸餾水中種子的根長。

FA、HA分離及含碳量測定：采用 GB7858—1987方法。稱5.0 g堆肥風干樣+100 mL浸提劑（0.1 mol·L-1Na2P2O7與 0.1 mol·L-1NaOH 等體積混合液）振蕩5 min，放在沸水中煮1 h，搖勻，離心后收集清液待測。（1）HA+FA總碳量的測定：吸取5—15 mL待測液于放有少量石英砂的試管中，逐滴加入0.5 mol·L-1硫酸，中和到pH=7出現渾濁，將大試管放在水浴上蒸發至近干，然后按重鉻酸鉀外加熱法測定總碳量。（2）HA總碳量的測定：吸取待測液20—50 mL于250 mL錐形瓶中加熱近沸，逐滴加入0.5 mol·L-1硫酸，使溶液pH調至2—3有絮狀胡敏酸沉淀產生，在水浴上 80 ℃保溫半小時，靜置過夜，使胡敏酸和富里酸充分分離。取細孔濾紙，用0.025 mol·L-1硫酸濕潤，再將上清液倒入過濾，用0.05 mol·L-1硫酸洗滌沉淀多次，直到濾液無色，棄去濾液。將胡敏酸沉淀用熱的 0.05 mol·L-1NaOH溶液洗滌溶解完全，過濾入100 mL容量瓶，直至濾液無色，定容搖勻。吸取定容液10—25 mL移入有石英砂的大試管中，用0.5 mol·L-1硫酸調至pH=7，使溶液出現渾濁，在水浴上蒸至近干，采用重鉻酸鉀外加熱法測定胡敏酸碳量。

表1 試驗材料基本性質Table 1 Basic properties of the tested materials

傅立葉紅外光譜掃描（徐玉坤等，2014）：將堆肥樣在60 ℃下烘干，粉碎過100目篩，在紅外干燥燈下與KBr混合研磨，制作壓片。采用傅立葉變換紅外光譜儀（德國布魯克VERTEX 80V）對壓片進行紅外光譜掃描，掃描光譜范圍為400—4000 cm-1。

1.4 數據分析

運用Excel對測定結果進行分析及作圖，OPUS軟件進行掃描光譜圖制作和分析。

2 結果與討論

2.1 堆肥過程中溫度的變化

圖1 菌渣堆肥過程中溫度動態變化Fig. 1 Changes of temperature during composting

堆肥過程中，3種處理的堆體溫度變化明顯。圖1顯示，堆肥過程中堆體共經歷了3次溫度升降階段，且在整個堆制過程中堆體溫度都明顯高于環境溫度，在堆制第38天時堆體的溫度基本穩定。堆肥初期，溫度上升迅速，堆肥第4天，堆體溫度均達到高溫（50 ℃以上），第8天堆體溫度達到第一階段峰值（C1：54.3 ℃，C2：52.3 ℃，C3：58.7 ℃），之后，溫度開始有所下降。第10天翻堆后，堆體溫度又逐漸回升，直至第24天，3種處理的堆體溫度一直處于相對穩定的高溫水平。第24天之后，堆體溫度總體呈動態下降趨勢，逐漸回落到一個相對穩定的低溫水平，至此堆肥過程結束。盡管堆制過程中3種處理的堆體溫度變化總體趨勢一致，但仍存在一定的差異。從圖中可以發現，C3處理的堆體的溫度在整個堆肥過程略高于C1、C2處理，尤其在堆肥的前兩個階段，在堆肥后期，3個處理之間的溫度變化無明顯規律。根據堆肥腐熟的溫度指標，堆肥過程中堆體溫度在 50 ℃以上保持 10 d，或60 ℃以上保持5 d，即可推斷，堆肥已達到腐熟條件（GB7959—2012）。堆肥初期，物料中易于降解的有機物及養分物質，如糖類、淀粉、蛋白質、脂肪等，在微生物作用下分解，并釋放出二氧化碳和熱量，堆體溫度迅速上升，達到 50 ℃以上。隨著過程進行，第一階段后期，溫度略有下降，主要由于隨著分解過程進行，堆體的氧氣供應量不足所導致。第10天堆體翻堆后，氧氣得到了補充，堆肥進入第二次升溫階段，除了易分解有機物的繼續分解外，在耐高溫細菌作用下，大部分較難分解的半纖維素、纖維素、木質素等也開始被氧化分解，同時釋放出熱量。到了這一階段的后期，堆體中能分解的有機物基本被分解完全，產生的熱量逐漸減少，溫度逐漸下降，后期溫度到達 40 ℃左右，堆肥已經基本穩定。之后，堆肥進入第三階段的熟化穩定期。一些微生物會借助殘留有機物生長，此時堆體溫度稍高于大氣環境溫度，并趨于穩定，有機物深度腐熟，堆肥過程結束。

2.2 堆肥過程中pH的變化

堆肥過程中不同時期 pH值的動態變化如圖 2所示。隨著堆肥時間的延長，堆體pH值總體都呈增加趨勢，其中菌渣與豆渣堆肥（C1）從初始的7.80上升至8.60；菌渣與雞糞堆肥（C2）從初始的7.71增加至8.34；菌渣堆肥（C3）從初始的7.76增加至8.41。隨著堆肥過程的進行，含氮的有機物分解礦化產生 NH3，使堆體 pH值緩慢上升至微堿性（Zucconi et al.，1981；Cegarra et al.，2006），堆肥末期，菌渣堆肥pH值略有下降可能是由于溫度下降后硝化細菌活性增強，硝化作用產生H+所致（周江明等，2015）。

圖2 菌渣堆肥過程中pH的動態變化Fig. 2 Changes of pH value during mushroom dregs composting

一般認為，堆肥初期微生物分解有機質產生有機酸，會導致pH降低，隨后溫度升高，一部分有機酸揮發，同時產生NH4+-N及NH3，致使pH升高，到堆肥末期隨著硝化作用的進行，NO3--N逐步積累，pH再次下降。本試驗初期pH值并未出現下降可能與試驗中加入了一定量的尿素，分解后轉化為NH4+-N及NH3有關。堆肥的pH值在7.5—8.5之間，可以獲得最大腐熟速率，過高會造成大量的NH3揮發，造成氮素損失（鮑艷宇等，2006）。堆肥最終產品的pH值也達到了通常認為的堆肥腐熟標準（pH 8.0—9.0）（李艷霞等，1999）。

2.3 堆肥過程中電導率（EC）的變化

電導率（EC）反映了堆肥過程中可溶性電解質的總量，在一定程度上與堆肥中的鹽濃度呈正相關。如圖3所示，試驗中3個處理的堆體EC值總體變化不大，在1.0—2.5 mS·cm-1范圍內浮動。在堆肥的各個時期C1處理和C2處理的EC值基本相近，且均高于C3處理，這是由于豆渣和雞糞的初始電導率均高于菌渣。Soumaré et al.（2002）建議將3000 μS·cm-1作為堆肥產品的EC最大限值。一般認為，當微生物代謝旺盛時，因分解有機物產生小分子有機酸、磷酸鹽、銨鹽等會導致EC值的上升（Abid et al.，2006），隨著二氧化碳、氨氣的揮發，各種礦物鹽離子的沉積，EC值會下降（李家祥，2012）。

圖3 堆肥過程中電導率（EC）的動態變化Fig. 3 Changes of EC during mushroom dregs composting

2.4 堆肥過程中C/N的變化

在堆肥過程中，有機物料在微生物作用下分解轉化，其中，部分碳源、氮源被微生物利用吸收，部分轉化為CO2、NH3（NH4+）、亞硝酸鹽和硝酸鹽以及腐殖質等，因此堆肥過程中的C/N在一定程度上可以反映堆肥的腐熟程度（羅泉達等，2009）。堆肥的固相C/N值從初始的25—30降到15—20時，認為堆肥達到腐熟（柴曉利等，2005）。從圖4可以看出，經過腐熟過程，各處理堆體的C/N總體都呈下降趨勢，至堆肥末期均降到了20以下，達到了堆肥腐熟的要求。

圖4 堆肥過程中C/N的動態變化Fig. 4 Dynamic changes of C/N during mushroom dregs composting

2.5 堆肥過程中GI的變化

種子發芽指數（GI）是通過測試堆肥浸提液的生物毒性來評價堆肥腐熟程度的指標。如果堆肥未腐熟，其中的一些成分會導致植物生長受到抑制，而在腐熟后其中的養分會促進植物生長。未腐熟堆肥的生物毒性，主要來源于堆肥中低分子量有機酸（如乙酸）和大量 NH3、多酚等物質（柴曉利等，2005）。如果GI大于50%，可認為基本腐熟；如果GI大于 80%，可認為堆肥已經完全腐熟（錢學玲等，2001；劉超等，2018）。圖5所示為堆肥過程中3個處理的GI動態變化結果，在堆肥初始階段，3種處理的堆肥對種子發芽存在明顯的抑制作用，種子發芽指數分別為20.60%（C1）、22.45%（C2）和19.78%（C3），隨著堆肥時間的延長，3種處理種子發芽指數都呈逐漸上升趨勢，至 21 d時，都超過50%。之后種子發芽指數繼續上升，至堆肥結束時，C1、C2分別為81.02%、83.36%，C3處理的種子發芽指數為72.46%。

圖5 菌渣堆肥過程中發芽指數（GI）的動態變化Fig. 5 Dynamic changes of germination index (GI) during mushroom dregs composting

從圖5可以看出，在整個堆肥過程中菌渣與雞糞堆肥的 GI值比對應的菌渣與豆渣堆肥、純菌渣堆肥的值大，說明菌渣與雞糞堆肥的浸提液對植物的毒性最小，但至堆肥結束時，菌渣與豆渣及菌渣與雞糞堆肥均已完全腐熟。于子旋等（2016）研究指出，種子的培養時間對 GI值有一定的影響，同樣的牛糞、雞糞及豬糞的堆肥44 d的浸提液培養種子24 h的GI值在70%左右，而培養48 h的則在90%。本試驗的種子培養時間為24 h，GI值在43 d時都在70%以上。有資料表明，如果種子發芽指數低，不一定是因為腐熟度低，還可能受堆肥產生的有機酸及氮的缺乏和鹽分含量影響（柴曉利等，2005）。因此，以GI作為堆肥腐熟度評判指標時，也應當綜合其他指標加以輔證。

2.6 堆肥過程中腐殖酸含量的變化

堆肥中腐殖質成分復雜，其中胡敏酸（HA）是分子量大小不等的一系列高分子縮聚物，而富里酸（FA）是腐殖質中分子量較小、活性較大、氧化程度較高的組分（王玉軍等，2009），它們的比值（HA/FA）稱為腐殖化指數，在一定程度上可以反映堆肥的腐熟程度（崔玉波，2013）。堆肥過程實質上是有機物轉化為腐殖質的過程，堆體內發生著礦質化作用和腐殖化作用。HA/FA可以有效地反映堆肥腐熟情況，其值的增大，表明堆肥中腐殖化作用程度的加深，堆體中形成了更多的高分子聚合物，這些大分子縮聚物是堆肥成品中腐殖質的有效成分。

從圖6可以看出，除C2處理（菌渣+雞糞）在堆肥前期略有下降外，堆肥過程中3種處理HA的含量均呈逐漸增加趨勢，其中3種處理的HA質量分數從堆肥初始至堆肥結束時分別為 26.01、35.68 g·kg-1（C1），23.43、33.34 g·kg-1（C2），27.34、40.58 g·kg-1（C3）。FA 含量在整個堆肥過程中無明顯變化，總腐殖酸含量隨著堆肥的時間的推進呈逐漸升高趨勢，這與張雪英等（2004）的研究結果相似，但與張盛華等（2014）的研究結果不一致，一般認為，堆肥過程中腐殖酸含量的差異與堆肥原料及堆肥條件關系密切。

圖6 菌渣堆肥過程中腐殖酸含量的變化Fig. 6 Changes of humic acid (HA) and fulic acid (FA) content during mushroom dregs composting

圖7 顯示，HA/FA隨著堆肥的進行，總體呈上升趨勢，表明堆肥的腐殖化程度和腐熟度增加。本研究結果表明，堆肥過程中胡敏酸含量明顯高于富里酸含量，這可能是由于堆肥過程中，腐殖質分解產生的低分子量富里酸一方面通過分子聚合產生大分子的胡敏酸，另一方面富里酸較胡敏酸易降解，使堆肥過程中HA/FA呈升高趨勢。

圖7 菌渣堆肥過程中胡敏酸與富里酸含量比值的變化Fig. 7 Changes of the ration of humic acid (HA) content to fulic acid(FA) content during mushroom dregs composting

2.7 堆肥過程中紅外光譜分析

大量研究表明，紅外光譜可應用于堆肥質量的快速評估（Francou et al.，2013；Yang et al.，2006；Albrecht et al.，2008；Fujiwara et al.，2007）。堆肥樣品的FTIR譜圖直觀地反映出3種堆肥方式在堆肥前后物質結構的變化。3種處理堆肥過程中紅外光譜圖如圖8所示，可以看出，3種處理的堆肥過程中均出現相似的吸收峰，說明3種處理堆肥含有的主要官能團相似，且主要的峰值吸收帶有3368—3428、2919—2926、1643—1653、1405—1421、1034—1058、528—606 cm-1。不同來源的腐殖質有類似的結構組成和官能團，結合前人的研究結果（徐玉坤等，2014；陳廣銀等，2008；孫文彬，2013），本研究中，3種處理樣品在堆肥過程中的具體的紅外光譜各主要吸收帶的歸屬及其可能物質來源見表2。

圖8 菌渣堆肥處理的紅外掃描光譜Fig. 8 FTIR spectra of mushroom dregs composts

隨著堆肥過程的進行，3種處理堆肥樣品特征吸收峰的強度均發生不同程度的變化。從圖7可以看出，雖然堆肥過程中3種處理的吸收峰相似，但各吸收峰的強度差異較大，隨著堆肥過程進行，菌渣+豆渣處理（C1）的堆肥樣品在各吸收帶的吸收峰強度逐漸增強；而菌渣+雞糞處理（C2）的堆肥樣品在各吸收帶的吸收峰的強度總體呈逐漸降低的趨勢，但在堆肥進行到第21天時各吸收峰的相對強度在整個過程中最大；菌渣處理（C3）的堆肥樣品，堆肥初期（堆肥第3天）各吸收帶吸收峰強度最弱，堆肥前期（9—15 d）各波段的吸收強度最大，堆肥中后期（21—43 d），各吸收帶吸收峰的強度無明顯變化，吸光強度介于堆肥前期兩種強度之間。

特征峰強度的大小可以反映官能團含量的相對高低，吸收峰相對強度越強，說明官能團的含量越高。結合表2得出，C1處理在3368—3428 cm-1吸收帶的相對強度逐漸增加，表明多糖類的小分子物質逐漸增加，由于加入了豆渣，樣品中含有的-OH和-NH含量較多；而C2、C3處理在此處的吸收峰強度則逐漸降低，C2和C3處理中易降解的碳水化合物在微生物作用下礦化分解，加之堆肥過程中水分的損失，使得碳水化合物和水分中的-OH吸收降低。

在 2919—2926 cm-1處吸收帶的相對強度增加，表明亞甲基和甲基含量的增加，堆肥中碳水化合物和木質素逐漸分解；吸收強度下降，說明堆肥過程中脂肪族含量降低。1600—1700 cm-1是苯環上的-C-C-和分子間或分子內形成氫鍵的羧酸中-C-O的伸縮振動吸收峰，在1643—1653 cm-1處吸收帶相對強度增加，表明堆肥中木質素得到了一定的降解，堆肥的芳香性增加。1405—1421 cm-1處吸收帶是碳水化合物和脂肪族化合物中 CH3-和-CH2-的彎曲振動峰，其變化與1643—1653 cm-1處吸收帶相似。3種堆肥處理在1034—1058 cm-1處吸收帶的強度有所增加，表明碳水化合物含量的增加，可能是生成一些類富啡酸類物質（陳廣銀等，2008）。528—606 cm-1處吸收帶的強度變化幅度不大，后期相對有所增強，因為生成了一些性質穩定的硅酸鹽類物質。

3種處理堆肥過程中含有的主要官能團相似，在堆肥的初始階段，有機物料在微生物作用下降解產生小分子的有機物質，如多糖類物質，這些物質隨著堆肥過程進行會被微生物進一步分解利用，有機物中不飽和結構的多聚化或聯合程度增大，芳香結構物質與氨基基團有所增加，說明堆肥過程中有機物質的變化規律先是易被微生物降解的有機物產生小分子的多糖以及蛋白質，這些物質進一步被分解利用，進而進入堆肥第二階段的易分解及難分解組分如木質素的分解，最后是腐殖質類物質的逐漸合成。但由于堆肥原料來源復雜，不同基團的吸收峰可能存在互相重疊干擾，單一的紅外光譜很難準確反映堆肥進程中物質的化學結構變化，未來對堆肥過程中有機物成分、結構的變化特征研究還需更先進的技術手段。

表2 堆肥過程各處理紅外圖譜特征峰歸屬Table 2 Characteristic peaks of infrared spectra during Mushroom Residue composting

3 結論

在整個堆肥過程中，堆體的腐熟分為3個階段，前兩個階段堆體溫度相對較高，高溫持續時間（＞50 ℃）達10 d以上。

堆肥結束時，堆體的pH值均在8.5左右，達到了堆肥腐熟標準（pH 8.0—9.0）；C/N值均低于20，達到了理想的腐熟要求；堆肥第21天時，3種處理的堆體GI值均超過50%，至堆肥結束，GI均在80%以上，堆肥完全腐熟；堆體EC值在堆肥過程中相對穩定，均在1.0—2.5 mS·cm-1范圍內浮動，符合腐熟堆肥對EC的要求；腐殖酸總量、胡敏酸的含量及二者的比值呈增加趨勢，有機物腐殖化程度增大。

紅外光譜分析結果顯示，3種處理堆體的官能團相似，堆肥進程中，小分子多糖類物質含量減少，有機物中不飽和結構的多聚化或聯合程度增大，芳香結構物質與氨基基團有所增加，腐殖化程度增加。