淋巴細胞亞群檢測及對結核病診斷和患者免疫狀況評價的價值

吳雪瓊

目前結核病(TB)依然是全球嚴重危害人類健康的慢性呼吸道傳染病，是全球十大死因之一，是單一傳染病的頭號殺手。盡管研究顯示85%～90%的活動性肺結核是由潛伏性結核感染(latent tuberculosis infectioin, LTBI)者發展而來的，但在全球約1/4的結核分枝桿菌(MTB)感染人口中，只有大約10%發病，90%終生不發病；而且TB具有家族聚集傾向，這些現象均說明人類在抗MTB感染方面存在遺傳差異。近年來，已發現了一些結核感染和發病的易感基因，大多數與免疫系統和炎癥反應相關，遺傳差異導致TB患者免疫功能異常或免疫缺陷，影響機體抵抗MTB感染的效力。因此，目前已認識到TB不僅是一種細菌感染性疾病，也是一種免疫性疾病，機體對MTB的免疫識別、免疫應答和免疫調控決定了MTB感染后疾病的發生、發展和轉歸[1-2]。

目前，可應用于臨床TB患者免疫功能評價的方法較少，主要有以下三類：(1)淋巴細胞亞群分析：包括淋巴細胞亞群的相對計數和絕對計數；(2)體液免疫功能分析：主要檢測血液及體液中結核感染相關抗體；(3)細胞免疫功能分析：主要檢測皮膚遲發型變態反應、細胞因子[如γ干擾素(IFN-γ)]水平和分泌IFN-γ的效應T細胞數。

淋巴細胞亞群已廣泛用于其他疾病的免疫功能評價，但在TB臨床應用不多，主要原因如下：(1)對TB患者免疫狀況在疾病發生、發展中的作用認識不足，重視不夠；(2)對這些免疫指標的臨床意義尚不十分清楚；(3)儀器、試劑價格昂貴，技術要求高，大多數實驗室條件有限，無法開展復雜的免疫檢測試驗。《中國防癆雜志》編委會于2019年5月23日在吉林省延吉市召開了淋巴細胞亞群檢測共識討論會，形成《結核病患者外周血淋巴細胞亞群檢測及臨床應用專家共識》，以便臨床醫師正確解讀、客觀分析、科學判斷結果，從而合理制定綜合的治療方案，提高TB的診斷和治療水平。筆者以下將重點探討淋巴細胞亞群檢測的進展、存在的問題和未來發展的前景。

淋巴細胞亞群檢測技術的主要進展

1.檢測技術發展[3]：1973年，Steinkmp通過激光激發雙色熒光色素標記的細胞進行計數和分選，建立了流式細胞術(flow cytometry，FCM)；同年Herzenberg與斯坦福大學合作研發出世界上第一臺商用流式細胞儀[熒光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting，FACS)儀]；20世紀80年代流式細胞術開始在臨床研究與應用，淋巴細胞亞群分析相對計數法也開始用于各類臨床疾病的免疫診斷和治療監測[4]；20世紀90年代定量流式細胞分析技術的問世，使淋巴細胞亞群分析更準確，實現了對外周血淋巴細胞的絕對計數[5]。早期國內淋巴細胞亞群分析大多采用相對計數法，近年來部分實驗室已同時開展相對計數法和絕對計數法[6]。隨著流式細胞儀光學系統和試劑的進步，儀器可配備多個激發器和檢測器，試劑出現更亮的新染料；多色流式細胞分析儀通過多種熒光抗體可以檢測淋巴細胞在不同生長水平及分化水平所表達的細胞表面抗原和細胞內抗原，在單細胞水平可測定多個參數，使得單一樣品可檢測高達14 個參數，從而可能對淋巴細胞亞群的不同特征進行多方面的鑒定[7]。

2.檢測指標增多：臨床上淋巴細胞亞群分析由只分析T淋巴細胞的CD3、CD4和CD8，發展到分析B淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、自然殺傷T細胞(natural killer T cells，NKT細胞)；由只檢測相對計數到絕對計數法；其他疾病進行相關檢測時，還對CD4+和CD8+T細胞進行精細分型，如幼稚T細胞亞群、記憶T細胞亞群、T細胞功能亞群和T細胞激活亞群等，為臨床患者提供較多的免疫評價指標。

3. 檢測標本擴展：淋巴細胞亞群檢測主要是檢測外周血，后來發展到可檢測胸腔積液和肺泡灌洗液[8-9]，以了解局部免疫功能。結核性胸腔積液以淋巴細胞為主，與外周血淋巴細胞結果相比，結核性胸腔積液表現為CD3+和CD4+T淋巴細胞亞群增多，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值增加，B淋巴細胞百分比和絕對計數均減少[8,10]；NK 細胞的占比明顯下降，其中CD56+CD16-NK 細胞亞群占比相對增加而CD56+CD16+NK 細胞亞群占比明顯減少，而且NK 細胞高表達記憶相關分子CD45RO、低表達初始相關分子CD45RA，提示結核性胸腔積液中可能存在一群記憶性NK 細胞[10]。活動性肺結核患者肺泡灌洗液及外周血中CD4+T淋巴細胞亞群百分比及CD4+/CD8+T淋巴細胞比值均明顯低于對照組(P<0.05)，而且患側也明顯低于健側；患側肺泡灌洗液中的NK 細胞水平也明顯低于健側 (P<0. 05)；肺泡灌洗液中CD8+T淋巴細胞亞群百分比明顯高于外周血(P<0.05)，而且患側明顯高于健側(P<0. 05)；但兩側CD3+T淋巴細胞百分比差異無統計學意義(P>0. 05)[9,11]。

淋巴細胞亞群百分比和絕對計數的關系

淋巴細胞亞群分析有兩種方法，其中相對計數法是分析各亞群細胞占總淋巴細胞數的百分比，因此，結果易受各類細胞亞群變化的影響。而絕對計數法可了解各類細胞亞群的獨立變化，一種淋巴細胞亞群絕對計數的變化不會影響其他細胞亞群絕對計數的變化；但可能影響淋巴細胞亞群相對計數的變化，如：大多數TB患者表現為CD4+T淋巴細胞絕對計數降低，導致其細胞百分比降低；CD8+T淋巴細胞絕對計數在TB患者中也會出現不同程度的降低，但其降低程度低于CD4+T淋巴細胞，因而相對計數時會出現CD8+T淋巴細胞百分比增高，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值可能不變或者降低[12-13]。T淋巴細胞在總淋巴細胞中所占百分比較高(50%～84%)，因此T淋巴細胞絕對計數或百分比變化必然會引起NK、NKT及B淋巴細胞的百分比發生相應改變[14]。肺結核患者CD3+CD56+CD16+/-NKT細胞和CD19+B淋巴細胞亞群的百分比和絕對計數均明顯低于對照組[15]。重癥TB患者各淋巴細胞亞群絕對計數均出現降低，但各淋巴細胞亞群百分比可能沒有明顯變化，仍處于正常范圍[16]。因此，只分析各淋巴細胞亞群的百分比不能客觀、準確地反映TB患者的免疫功能狀況，建議同時檢測與分析淋巴細胞亞群的相對計數和絕對計數。

γ干擾素釋放試驗(IGRA)檢測結果與外周血淋巴細胞及淋巴細胞亞群的關系

IGRA的兩種成熟檢測技術——酶聯免疫斑點(ELISPOT)試驗與酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測的敏感度均隨著外周血淋巴細胞計數的降低而明顯降低， ELISPOT試驗結果相對ELISA而言較不受淋巴細胞計數的影響[17]。當外周血淋巴細胞數低于500個/ml時， ELISPOT試驗的敏感度為81%，而ELISA的敏感度降為39%[17]。由此可見，在低淋巴細胞計數的情況下，ELISPOT試驗優于ELISA。

CD4+T細胞和CD8+T細胞計數與外周血淋巴細胞數呈明顯線性相關，CD4+T細胞是產生IFN-γ的主要細胞類型，少量CD8+T細胞也被誘導產生IFN-γ[18]。IGRA檢測結果與CD4+T細胞和CD8+T細胞計數密切相關，IGRA檢測陽性者的CD4+T細胞和CD8+T細胞絕對計數大多在正常范圍，也就是說CD4+T細胞和CD8+T細胞絕對計數在正常范圍患者的IGRA陽性率明顯高于其他患者。IGRA對活動性肺結核的陽性預測值(PPV)很低[19]；IGRA最大的優點就是陰性預測值(NPV)非常高[20]，但CD4+T細胞和CD8+T細胞絕對計數明顯低于正常范圍的患者易出現假陰性結果，同時也會因為免疫低下而導致內源性復燃的風險增高[21]。因此，IGRA用于檢測高風險人群的LTBI時，建議同時分析淋巴細胞亞群的絕對計數，以避免由于IGRA假陰性造成遺漏而導致活動性肺結核的發展[22]。

MTB/HIV共感染與淋巴細胞亞群的關系

人類G蛋白偶聯因子超家族(GPCR)成員的細胞膜蛋白趨化因子CCR5是HIV-1入侵機體細胞的主要輔助受體之一。目前的研究發現，TB相關的慢性免疫激活可使患者機體CCR5+表達增強、CCR5+CD4+T細胞頻率增高，從而導致HIV優先靶向MTB 特異的記憶性CD4+T細胞，使 MTB 特異的CD4+T細胞在HIV感染早期就從外周血中消失[23-25]。MTB/HIV共感染導致MTB特異性T細胞功能分層喪失，首先是白細胞介素(IL)-2+CD4+T細胞反應喪失，其次是腫瘤壞死因子(TNF)-α+CD4+T細胞喪失，IFN-γ+CD4+T細胞最后喪失，提示IL-2的分泌能力可能在TNF-α或IFN-γ之前首先喪失。HIV感染的LTBI者中MTB特異性CD4+T細胞的耗竭在IFN-γ+IL-2-TNF-α+亞群中最為明顯，MTB特異的CD4+T細胞的快速耗竭使感染HIV的LTBI者患活動性TB的風險明顯增加[26-27]。MTB特異性IL-2+TNF+或IFN-γ+CD4+T細胞數與HIV病毒載量呈負相關，MTB/HIV共感染者隨著HIV-1感染病情的進展、免疫抑制增強會導致MTB特異性多功能CD4+T細胞反應喪失。HIV感染者中抗原特異性CD8 T細胞早期表現為CD27+/CD28+(早期分化表型)，隨后CD28表達喪失(CD27+/CD28-，呈中間分化表型)，晚期CD27表達喪失(CD27-/CD28-，呈晚期分化表型)[28]。而MTB感染者正好相反，MTB特異性CD8 T細胞表現為CD28+高表達，CD27+低表達，首先是CD27表達喪失[27]。 MTB/HIV共感染會損害MTB特異性細胞免疫反應，不能在MTB激活下抑制其復制，導致疾病進程加快，極大地增加了活動性肺結核發病的風險。此外，CD4+T細胞對MTB呈現強反應的同時可能也增強了HIV的復制[29]，因此，MTB/HIV共感染者的HIV病毒載量一般高于單獨HIV感染者，反復或持續的共感染明顯增加了HIV病毒載量，從而增加HIV傳播的風險和艾滋病的發病率[30]。

衰老與淋巴細胞亞群的關系

隨著人體的衰老，發生免疫系統的衰退被稱為免疫衰老，導致細胞免疫應答和體液免疫應答降低，外周血淋巴細胞亞群發生一系列變化；其中CD3+、CD4+和CD8+T細胞減少，記憶性CD4+、CD8+T細胞增多，T細胞CD28表達減少對于免疫系統的衰老具有重要意義[31-32]。CD8+T細胞會隨著年齡的增長而下降，而且明顯早于CD4+T細胞。CD28分子是效應CD4+和CD8+T細胞的重要共刺激標記物，在出生時幾乎所有的T細胞都表達CD28，隨著年齡的增長胸腺退化，與其相關的幼稚CD28+T細胞輸出逐漸減少，至80歲50%～60%的CD8+T細胞失去CD28的表達，導致免疫表型減弱[33]。老年人CD8+CD28-T細胞的表達頻率明顯高于CD4+CD28-T細胞，CD28-T細胞雖然可增強細胞毒性和調節功能，但具有降低抗原受體多樣性、抑制抗原誘導的增殖、縮短復制壽命的作用，可能導致老年人免疫功能低下，對新病原體和疫苗的反應受損[34]。因此，CD28-T細胞可作為老年人免疫功能不全的一個重要預測因子。相反，老年人NK細胞和CD19+B細胞的絕對計數和百分比可能變化不明顯，但CD56+NK細胞百分比降低、CD56-NK細胞增加[31,35]；B細胞多樣性明顯下降，由于B細胞可產生抗體，也是有效的抗原遞呈細胞，因此導致免疫力下降[36]。由此可見，對于老年TB患者進行淋巴細胞亞群分析，評價免疫功能，對于制定合理的綜合治療方案是非常需要的。

需建立新的基于多色流式細胞術檢測T淋巴細胞亞群的方法

目前，TB臨床檢測淋巴細胞亞群的類型有限，對淋巴細胞亞群功能的評價不足，尚不能完全滿足臨床需求，需研發、開展新的針對TB患者臨床免疫學特征的淋巴細胞亞群的分析指標和方法，以指導臨床診療。如通過流式細胞術將T淋巴細胞分為中心記憶T細胞(T central memory，TCM)、效應記憶T細胞(T effector memory，TEM)、效應T細胞(T effectorcells，TE)和幼稚T細胞(naive T cells)，通過分析TEM/TCM 的比值可作為了解MTB感染的標志物，痊愈TB患者的TEM和TCM對早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)均有反應，而IFN-γ陰性個體只有TCM反應；TCM占優勢者通常體內無MTB增殖，而TEM占優勢者體內可能有MTB增殖[37]。

CD4+T細胞在TB患者抗感染免疫中發揮著重要的作用，可以作為一個相對獨立的分析指標。CD4+T細胞根據其分泌的細胞因子和介導的功能不同可以進一步分為輔助性T淋巴細胞(Th細胞)1(Th1細胞)(IFNγ+CD4+)、Th2細胞(IL-4+CD4+)、Th17細胞(IL-17+CD4+)、Th9細胞(IL-9+CD4+)、Th22細胞(IL-22+CD4+)，以及具有免疫抑制功能的調節性T細胞(Treg，CD4+CD25+Foxp3+)等細胞亞群。IFN-γ+CD4+在與TB密切接觸者和免疫抑制劑使用者中對LTBI診斷的敏感度明顯高于IGRA和PPD皮膚試驗[38]。此外，可從細胞免疫功能方面進一步精準地評估TB患者的免疫狀態，如通過流式細胞術分析T細胞表面的細胞因子也可診斷MTB感染，如LTBI者的外周血單個核細胞(PBMC)中分泌IL-2/IFN-γ的CD4+T細胞比率明顯高于活動性TB患者；活動性TB患者隨著治療好轉、MTB載量下降，分泌IL-2/IFN-γ的CD4+T細胞比率也會逐步升高。應用多色流式細胞術評價MTB特異的CD4+或CD8+T細胞免疫激活標志物的表達，TB患者MTB特異的CD4+IFNγ+T細胞表達免疫激活標志物CD38、人類白細胞抗原DR等位基因(HLA-DR)和細胞內增殖標志物Ki-67的頻率明顯高于LTBI者[39]。最近發現Th17細胞的主要表面標志物CD161+T細胞在活動性TB患者中明顯低于LTBI者和正常人[40]，這些標志物可能能夠鑒別活動性TB和LTBI。

細胞免疫應答在抗結核免疫中發揮了關鍵作用，未來隨著流式細胞術的進步與推廣將會極大地促進TB診治各領域的發展，如TB診斷試驗的建立、基礎免疫的了解、疫苗接種效果的評估等[41]，也許能夠解決全面評價TB患者淋巴細胞亞群表型和功能分析的難題。FACS可能成為診斷TB、判斷疾病嚴重程度和治療效果的重要手段之一。