核酸適配體在肺腺癌診斷和治療中的應用現狀及研究進展

李名一，姜良勇，高 川，劉媛媛

(1.佳木斯大學附屬第一醫院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154004；2.佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

20世紀末，單克隆抗體(mAb)技術的出現給醫學攻克癌癥帶來了希望。但是它并沒有達到預期效果，之后隨及出現了一種使生物分子特異性結合的技術，它就是我們現在所熟知的適配體，aptamer(適配體)來源于拉丁語“aptus”，意思是“西服”，希臘語后綴“meros”意為“部分”，這說明適配體具有與特定目標進行互動的潛力。是最早由Ellington等[1]和Tuerk等在1990年提出，核酸適配體是從一種人工合成的寡核苷酸文庫中篩選得到單鏈寡核苷酸， 可以是單鏈 DNA， 也可以是RNA[2]。分子量約為10 ～ 30 kDa，明顯小于抗體。DNA相對而言，它在體外會更穩定?？梢酝ㄟ^三維互補，不是堿基配對，來識別目標，并與目標結合，特異性和親和力高，有或幾乎沒有免疫原性，不會引起免疫排斥反應[3]。同樣它們也被叫做"核酸抗體"。迄今為止，適配體已經應用于很多的生物和醫學領域，從生物成像、疾病診斷、靶向治療以及給藥。它們在臨床和實驗室環境中顯示出非常大的潛力。它是一種短小的單鏈寡核苷酸，可以折疊成獨特的3D結構。適配體，它是通過一種被稱為"指數富集配體的系統進化"(SELEX)技術篩選出來的。這種Cell-SELEX技術篩選的靶標有癌細胞，正常細胞和炎癥細胞等，器官和組織也有很多，有腦、肺、肝、胰腺、乳腺和卵巢等。其中SELEX主要包括毛細管電泳-SELEX (CE-SELEX)、細胞SELEX、快速SELEX。Cell-SELEX的主要優勢在于，與以前的SELEX技術相比，Cell-SELEX的選擇過程可以在不需要靶蛋白基礎上進行。但是Cell-SELEX也有一些缺點，比如它需要更多的篩選時間，對目標細胞的任何損傷都會影響篩選結果。適配體的優點：(1)它具有非常廣泛的靶標范圍；(2)適配體制備時間較短，它是在體外制備，從而避免了長時間免疫；(3)適配體易于修飾，有較高的穩定性；(4)適配體的批與批之間的變化較少；(5)適配體的制備成本比單克隆抗體低；(6)高組織滲透率(由于它們的小尺寸)，脫水形式的穩定性高，易于化學合成；(7)適配體可長期保存；(8)適配體對溫度不敏感，可耐受80℃，而單克隆抗體則變性；(9)適配體分子量較小，治療時很容易穿透腫瘤等組織。此外，適配體還具有靶點廣泛、有高特異性、高親和力、低免疫原性、納米尺寸(直徑約1 ～ 2nm)等諸多優點。

1 核酸適配體用于肺腺癌早期診斷和治療的現狀

肺癌仍然是我國死亡率的榜首，它嚴重的危害了人類的健康。肺癌有兩種組織學類型：非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)，非小細胞肺癌占肺癌病例的80%以上。疾病的分期影響非小細胞肺癌患者的預后，5年生存率低[4]。其中非小細胞肺癌可以分為三個亞型：腺癌、鱗癌和大細胞肺癌。盡管肺癌的篩查、診斷和治療取得了很大的進展，但是有約70%的患者在目前的醫療環境下很難被診斷出來，導致肺癌預后不良。因此，早期診斷與治療是提高肺癌患者生存率的關鍵。然而，目前大多數的肺癌診斷方法，如X射線、螺旋CT、MRI、PET/CT、纖維支氣管鏡檢查、縱隔鏡檢查，光學相干斷層掃描、正電子發射斷層掃描[5]，都是基于形態學標準的，但是這些標準對早期發現不敏感，對癌癥也不特異。因此，非小細胞肺癌的早期診斷和治療越來越依賴于分子探針的開發，這些探針可以識別肺癌發生發展中的異常，并使臨床醫生能夠識別不同的亞型。尋找更多臨床上有效的肺癌生物標志物以及肺癌診斷仍是一項具有挑戰性的工作。適配子作為一類用于疾病診斷和治療的新型分子探針引起了人們的極大關注。目前為止，已經用這種方法篩選出了針對白血病細胞、肝細胞和小細胞肺癌細胞的適配子。最常見的腫瘤標記物主要包括神經元特異性烯醇化酶(NSE)[6]、前列腺特異抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、CA25、CA53、CA199,然而傳統的肺癌診斷技術靈敏度特別低，不能發現早期肺癌患者，因此核酸適配子代替抗體用于臨床檢測和治療已經成為大勢所趨。

研究發現，一種新型的Gal-1靶向DNA適配子(AP-74M-545)，通過恢復免疫功能來證明該適配子的抗腫瘤作用，AP-74M-545與Gal-1高親和力結合。數據表明，Gal-1適配子通過阻斷Gal-1和CD45之間的相互作用而抑制腫瘤生長，從而從凋亡中拯救T細胞，恢復T細胞介導的免疫。這些結果表明AP-74M-545可能是一種潛在的腫瘤免疫治療策略。Kun Li等人首次以肺癌患者血清為靶點，在肺癌患者血清中篩選出6種與腫瘤標志物具有特異性親和力的DNA適配子，為肺癌的早期診斷提供了一種新的高效、準確的方法。研究通過消減SELEX技術篩選與肺癌患者血清有較強親和力的特異性核酸適配子，將羧化瓊脂小球在不同篩選參數下與肺癌患者血清蛋白結合，最終獲得6種特異性核酸適配子。為了去除靶分子，例如非靶物種的核酸適配子，首先進行陰性篩選。隨后，將回收的上清液和磁珠與肺癌患者血清一起孵育進行陽性篩選，然后在95℃下處理，獲得肺癌患者血清的特異性ssDNA文庫。獲得的ssDNA文庫通過實時定量PCR技術擴增，然后結合鏈霉親和素-親和素小球制備二級ssDNA文庫，為下一步適配子的篩選做準備。最后，通過第二代基因高通量測序分析來確定富集的適體序列和特異結合靶分子的適體序列的富集含量。結果顯示所獲得的6個適配子對肺癌患者血清具有特異性親和力，而對健康人血清沒有特異性親和力，表明所獲得的適配子對肺癌患者血清具有較高的特異性親和力。

2 核酸適配體偶聯藥物在肺腺癌治療中的應用現狀

表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)厄洛替尼在肺癌治療中具有良好的療效。不幸的是，攜帶TKI耐藥EGFR突變的個體通常會對厄洛替尼產生獲得性耐藥性。為了克服這種耐藥性，有研究者開發了以抗表皮生長因子適體(APT)結合殼聚糖(APT-Cs)為穩定載體的脂質體，脂質體因其固有的生物相容性和生物降解性而被認為是一種很有前途的藥物載體，具有親水核和疏水殼的雙層納米材料，可以包裹水溶性較差的厄洛替尼[7]。將厄洛替尼輸送到靶部位，將厄洛替尼負載到apt-Cs錨定的脂質體復合物(apt-CL-E)中，并表征了apt-CL-E的理化性質，該納米粒表現出良好的生物穩定性和對APT引導的EGFR突變的癌細胞的結合特異性。這種特異性結合促進了apt-CL-E在EGFR突變的癌細胞中的攝取。細胞毒性研究表明，APT-CL-E在將厄洛替尼輸送到EGFR突變的癌細胞中，導致細胞周期阻滯和凋亡方面比其非靶向脂質體具有優勢。

腫瘤疾病化療也會發生耐藥性，所以通過內吞作用選擇性靶向給藥，可以減少藥物劑量和不良反應，同時也能最大限度地提高治療效果。德國學者開發了一種疏水性化療藥物(如紫杉醇，PTX)的靶向給藥平臺，其基礎是聚乙二醇(PEG)與聚己內酯(PCL)形成PEG-PCL膠束，并以APTS為靶向基團。這些APT-NPs選擇性地將PTX靶向NSCLC A549細胞模型，并有效地清除了它們，同時避免了對正常人其他器官的的毒性作用。結論研制了一種生物相容性嵌段共聚物PEG-PCL膠束包埋疏水性化療藥物PTX的給藥系統。研究了核酸適體修飾的納米粒子在藥物穩定和腫瘤靶向方面的雙重作用，確定了納米粒子上最佳的適配體的濃度，負載PTX的APT(30)-NPs的尺寸約為15 nm(即在用于癌細胞靶向的理想尺寸范圍內：10-50 nm)。這一顯著的治療窗口可以促進最小劑量藥物的給藥，同時提高化療藥物治療的療效，減少副作用，并降低治療成本。

3 核酸適配體在肺腺癌應用中面臨的問題及解決方法

由于我們目前對于疾病的診斷仍然不夠準確，核酸適配體，它作為一種新型的分子探針[8]，將提供了一種全新的方法，從而對疾病進行診斷和靶向治療。"適配子"它們是在體外從隨機序列池中挑選出來的。與以前的血清學腫瘤標志物檢查相比，腫瘤標志物篩選出的核酸適配體具有很高的特異性，加上影像學檢查結果，能夠使肺腺癌早期診斷更加準確。核酸適配體有很多優勢，還能進行適配體-藥物偶聯，作用于某個靶點，起到靶向治療的作用，從而降低化學藥物的毒性作用。同時一些適配體還可以被開發成生物傳感器。但是核酸適配體是一把雙刃劍，它還存在著一些問題：(1)它的穩定性較差，從體外篩選得到的適配體在體內容易被核酸酶降解[9]；(2)適配體，體積小(約20kDa)，它可以迅速地從循環中清除，因此表現出較差的藥動學和治療潛力。對于這些缺點，可以從以下幾個方面來解決上述問題(1)通過一些化學修飾，可以提高核酸適配體的核酸酶抗性；(2)篩選具有穩定結構的適配體，如G-四聚體可以提高核酸適配體的穩定性；(3) 解決核酸適配體易被腎臟過濾清除的問題，與大分子生物偶聯，比如偶聯一些納米材料。上述方法均可提高核酸適配體在體內應用的有效性，隨著研究的深入，核酸適配體現如今應用于肺腺癌早期診斷和靶向治療，給腫瘤的診斷和治療注入了新的生機。；雖然不同癌細胞系的許多適配子都在開發，但是當前廣泛應用的適配體的種類仍然非常有限，遠遠不能滿足人們的實際需求，因此研發更多的核酸適配體用于癌癥的診斷與治療，將會使更多患者得到更好的治療。