廣棗總黃酮對三氧化二砷誘導心肌細胞損傷的作用

楊秀華 智 慧 艾 丹 肖云峰

1.呼倫貝爾職業技術學院蒙醫蒙藥系，內蒙古呼倫貝爾 021000；2.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古呼和浩特 010110

三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）俗稱砒霜，是最古老的毒藥之一，外用殺蟲去腐，內服截痰平喘，攻毒抑癌[1]，也被用于治療結核、銀屑病、梅毒等疾病[2]，現用于急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）的治療[3-4]，對乳腺癌[5-6]、肝癌[7-9]、胃癌[10]等惡性腫瘤也可發揮較好的效果，應用前景良好[11-12]。但是，ATO 屬于劇毒藥物，在治療腫瘤的過程中所引起的心臟毒性，限制其在臨床上的廣泛應用。長期使用可致Q-T 間期延長[13]、尖端扭轉型室速[14]、甚至心源性猝死[15-17]。因此，如何減少ATO 在應用過程中產生的心臟毒性，是現代藥理學研究的重點內容之一。廣棗是漆樹科植物南酸棗的成熟果實，為蒙醫常用藥材，在治療心血管疾病的藥方中，半數以上是以廣棗為主藥或是配伍有廣棗[18]。廣棗總黃酮（total flavnoids of fructus choerospondiatis，TFFC）是廣棗治療心血管系統疾病的主要活性成分，具有抗心律失常[19-20]、增強免疫力[21]、改善心肌缺血[22-23]等作用，可以清除心肌缺血時產生的大量氧自由基[24-25]，保護心肌免受嚴重損傷。本研究深入的探討蒙藥廣棗對ATO 誘導心肌損傷的作用，為TFFC 減輕ATO 產生的心肌損傷提供重要的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

CCK-8 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，13H30C60）；Hoechst 染色試劑（上海碧云天公司，051618180905）；倒置生物顯微鏡（德國Leica 公司，DM3000）；CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；全自動生化分析儀（愛爾蘭apphire 公司，Multiskan MK3）；流式細胞儀（美國Merck 公司，guava easyCyte）；健康清潔級Wistar 乳鼠25 只（雌雄不限，1～3 d，5～9 g）購自內蒙古醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證編號：SCXK（蒙）2015-0001，飼養于內蒙古醫科大學動物實驗中心（溫度20～26℃，濕度40%～70%），動物飲水為無菌水，每天定時喂食，每隔2 d 更換1次墊料。所有動物實驗經過內蒙古醫科大學動物管理協會批準進行，符合內蒙古醫科大學倫理委員會動物實驗相關要求。

1.2 原代乳鼠心肌細胞的培養與分離

在無菌條件下取新生Wistar 乳鼠的心尖組織，置PBS 液清洗，移至0.1%胰酶中，剪碎，加入6 ml 0.1%胰酶消化6 min，靜置后棄上清。再加入5 ml 混酶，消化5 min，靜置后吸上清轉移至玻璃瓶中，加入5 ml 10%FBS 的培養基終止消化，重復10 次。1000 r/min（r=13.5 cm）離心10 min，棄上清，用20%FBS 的培養基重懸，置培養箱內培養60 min，轉移至新培養瓶，繼續培養48 h 后進行后續實驗[26]。

1.3 心肌細胞形態學觀察

在倒置顯微鏡下觀察培養0、12、24、48、72 h 以及7 d 的心肌細胞的生長情況與細胞的形態。

1.4 細胞分組及處理

實驗設置空白組、模型組（ATO 6 μg/ml）、TFFC高濃度組（TFFC 100 μg/ml+ATO 6 μg/ml）、TFFC 中濃度組（TFFC 50 μg/ml+ATO 6 μg/ml）、TFFC 低濃度組（TFFC 25 μg/ml+ATO 6 μg/ml）。空白組加入無血清DMEM/F12 培養基培養12 h 后換用無血清DMEM/F12 培養基培養12 h；模型組加入無血清DMEM/F12 培養基培養12 h 后換用終濃度為6 μg/ml ATO 培養基培養12 h；TFFC 低、中、高濃度組分別加入終濃度為25、50 μg/ml 和100 μg/ml TFFC 培養基培養12 h 后換用終濃度為6 μg/ml ATO 培養基培養12 h。

1.5 CCK-8 法檢測細胞存活率

按“1.4”分組處理后，每孔加入10 μl CCK-8 試劑，培養1 h，于酶標儀450 nm 處測量吸收度值，計算存活率，實驗重復6 次，取平均值。

1.6 各心肌酶及抗氧化酶檢測

培養液中谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、磷酸肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活力的檢測：按“1.4”分組處理后，采用全自動生化分析儀檢測，重復6 次，取平均值。

細胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力的檢測：按“1.4”分組處理后，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測，重復6 次，取平均值。

1.7 細胞凋亡的測定

1.7.1 Hoechst 33342 染色觀察心肌細胞凋亡水平按“1.4”分組處理后，棄培養液。加入Hoechst 33342染液250 μl，避光孵育30 min，使用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。

1.7.2 Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒檢測心肌細胞凋亡率 按“1.4”分組處理后，用0.25%胰酶消化收集細胞，后續操作嚴格按照說明書進行，用流式細胞儀在1 h 內檢測細胞凋亡率，實驗重復3 次，取平均值。

1.8 統計學方法

采用Graphpad Prism8.0 軟件和SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，多組比較采用方差分析，兩組比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以例數表示。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞形態學觀察

剛分離純化的細胞多為圓形，見圖1A；培養12 h細胞已部分貼壁，多數仍為圓形，見圖1B；培養24 h細胞大部分已貼壁，多數呈梭形、圓形，少數細胞有自發性搏動，見圖1C；培養48 h 細胞基本都貼壁，大多數細胞伸出偽足伴有自發性搏動，見圖1D，此時的細胞可用于后續實驗；培養72 h 細胞形成細胞簇，成放射狀排列，且同步搏動，見圖1E；培養5～7 d 的細胞形成細胞層，搏動快而強且同步化，見圖1F。

圖1 倒置顯微鏡下心肌細胞的形態（100×）

2.2 CCK-8 法檢測心肌細胞活力

與空白組比較，模型組細胞存活率顯著下降，差異有高度統計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，TFFC 各濃度組細胞存活率顯著升高，差異有高度統計學意義（P ＜0.05）。TFFC 中、高濃度組細胞存活率高于TFFC 低濃度組，且TFFC 高濃度組高于TFFC中濃度組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 TFFC 對ATO 誘導心肌損傷的保護作用（n=6）

2.3 TFFC 對心肌酶和抗氧化酶活力檢測結果的影響

與空白組比較，模型組細胞培養液中GOT、CK 和LDH 的活力顯著升高，心肌細胞中SOD、GSH-Px、CAT 活力顯著降低，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與模型組比較，TFFC 各濃度組細胞培養液中GOT、CK和LDH 的活力均顯著降低，心肌細胞中SOD、GSH-Px、CAT 活力顯著升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1～2。

表1 各組心肌細胞培養液中GOT、CK、LDH 比較（U/L，，n=6）

表1 各組心肌細胞培養液中GOT、CK、LDH 比較（U/L，，n=6）

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TFFC：廣棗總黃酮；GOT：谷草轉氨酶；CK：磷酸肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶

表2 各組細胞中SOD、GSH-Px、CAT 比較（，n=6）

表2 各組細胞中SOD、GSH-Px、CAT 比較（，n=6）

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TFFC：廣棗總黃酮；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；CAT：過氧化氫酶

2.4 Hoechst 33342 染色觀察心肌細胞凋亡形態

空白組心肌細胞呈均一核染，呈現均勻的低強度熒光，且未見核異常，見圖3A；模型組細胞呈亮藍色，凋亡細胞數目增多，見圖3B；TFFC 低、中、高濃度組藍色熒光強度明顯減弱，見3C～E。

圖3 Hoechst 染色觀察心肌細胞凋亡形態（100×）

2.5 Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒檢測心肌細胞凋亡率

空白組僅有少部分細胞發生凋亡，見圖4A；模型組凋亡細胞數目明顯增加，見圖4B；TFFC 各濃度組細胞的凋亡情況均不同程度得到改善。見圖4C～E。與空白組比較，模型組細胞凋亡率顯著增加，差異有統計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，TFFC 各濃度組細胞凋亡率均顯著降低，差異有統計學意義（P ＜0.05）。TFFC 中、高濃度組細胞存活率低于TFFC 低濃度組，且TFFC 高濃度組低于TFFC 中濃度組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見圖5。

圖4 流式細胞圖

3 討論

本研究在傳統的原代心肌細胞培養基礎上進行改良優化，從鼠齡、消化酶的種類、濃度、時間、程度及差速貼壁時間等多個方面進行考察，成功構建了良好的乳鼠原代心肌細胞的模型。利用6 μg/ml ATO 建立體外心肌氧化損傷模型，CCK-8 檢測結果顯示，ATO可顯著降低心肌細胞的活力，而TFFC 各濃度組均可明顯增加ATO 誘導狀態下心肌細胞的活力。

評定心肌受損的重要標志之一是心肌酶表達水平的變化，臨床上常以LDH、CK、GOT 活力升高作為判斷心肌受損的診斷指標[27]。正常生理狀態下，心肌細胞培養液中LDH、CK、GOT 的活力較低，而當心肌細胞膜受損時，心肌酶漏出量將顯著增加。研究結果顯示，TFFC 低、中、高濃度組均能夠顯著降低ATO 誘導的細胞培養液中LDH、CK 和GOT 活力，提示TFFC能夠抑制受損細胞的LDH、CK、GOT 漏出，維護細胞膜的完整性，改善心肌的受損程度。CAT、GSH-Px 和SOD 是體內重要的抗氧化酶，是評估機體抗氧化防御體系功能的重要指標。CAT 可將過氧化氫分解為水和氧氣，清除體內的過氧化氫，防止過量的過氧化氫對機體造成的損傷。GSH-Px 通過維持機體氧化與抗氧化平衡，而使細胞膜免受過氧化物的損傷。SOD 是重要的自由基清除劑，廣泛存在于生物體的各組織中，可對抗和修復氧自由基對心肌組織所造成的損傷[28-29]，本實驗結果顯示，TFFC 各濃度組心肌細胞中CAT、GSH-Px 和SOD 活力較ATO 模型組顯著升高，提示ATO 抑制內在的保護性抗氧化能力來誘導心肌細胞的氧化應激，TFFC 具有較好的抗氧化作用，有利于減輕由ATO 誘導的心肌損傷。

心肌細胞凋亡是導致心肌損傷的重要發病機制之一。Hoechst 33342 熒光染色可以直觀觀察心肌細胞的凋亡狀態，AV/PI 雙染流式檢測實驗可以用來區分細胞的不同存活狀態，定量檢測心肌細胞的凋亡率。通過Hoechst 33342 熒光染色可知，模型組細胞呈亮藍色，提示凋亡細胞數目較多，而TFFC 各濃度組藍色熒光強度明顯減弱，提示TFFC 可以改善心肌細胞凋亡狀態。流式細胞儀檢測細胞凋亡率可知，模型組凋亡細胞及壞死細胞數目較多，而TFFC 各濃度組可以顯著降低凋亡率，對ATO 損傷的心肌細胞凋亡具有明顯的抑制作用，課題組下一步將展開TFFC 調控具體凋亡基因的研究。

本研究認為TFFC 對ATO 誘導的心肌細胞損傷具有顯著的保護作用。提示TFFC 與ATO 的組合可能有益于防止ATO 誘導的心臟毒性，TFFC 在心血管疾病的治療中能夠發揮重要作用。