桑芪首烏片對局灶性腦缺血再灌注大鼠BDNF及其受體TrkB表達的影響

顧力華， 陳奇剛， 陸家龍， 魏丹霞， 楊仁華， 陳鵬， 司林閣

（1.昆明市中醫醫院，云南昆明 650559；2.昆明醫科大學，云南昆明 650500；3.云南中醫藥大學，云南昆明 650500）

腦梗死是最常見的腦血管疾病之一，存活患者有70%～80%致殘[1]。積極有效地促進患者神經功能的恢復是治療本病的重點和難點。國家級名中醫陸家龍主任醫師以數十年的臨證經驗方桑芪首烏方在對腦梗死偏癱患者的臨床治療觀察中顯示其有較好療效[2]。本研究應用由桑芪首烏方制備成的桑芪首烏片，觀察其對大鼠腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后腦缺血再灌注損傷時腦神經源性神經生長因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）及其酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）表達的影響，以探討該方對腦梗死大鼠腦神經的保護作用及機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠70只，體質量（200±20）g，購自昆明醫科大學實驗動物學部，許可證號：SYXK（滇）K2015-0002。動物飼養室溫度（22±2）℃，相對濕度50%～65%，自由光照。

1.2 藥物 桑芪首烏片，由桑寄生、首烏、黃芪等12味中藥組成，由昆明市中醫醫院制劑科提供。天麻鉤藤顆粒（成都九芝堂金鼎藥業有限公司，20 mg/片，批號：20151213）；尼莫地平片（山東新華制藥股份有限公司，20 mg/片，批號：20151121）。

1.3 主要試劑與儀器 BDNF、TrkB即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒[賽默飛爾（Invitrogen）中國公司]。電熱恒溫培養箱（中國上海精宏實驗設備有限公司）。

1.4 局灶性腦缺血再灌注大鼠模型制備 SD大鼠經適應性喂養1周后開始造模，實驗前動物禁食12 h，自由飲水。參照相關文獻[3-7]，采用改良線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型。SD大鼠用100 g/L水合氯醛按0.35 mL/100 g（體質量）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸部手術區剔毛。沿頸中線切口，分離左側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎頸總動脈和頸外動脈。用微動脈夾暫時夾閉頸內動脈，然后近心端結扎頸總動脈和頸外動脈。在頸總動脈距其與頸內動脈交叉4 mm處剪45°斜口，將拴線插入到頸內動脈，從血管分叉處計算，插入長度18 mm時要放松血管保持原來狀態。再輕輕往前插，當稍有阻力增大，即停止插入。頸內動脈打結，防止線栓滑脫。縫合各層組織，使線一端露出皮膚約0.5 cm。缺血2 h，拔出線栓，形成再灌注損傷。假手術對照組大鼠僅沿頸中線切口，不分離血管和結扎。模型制備成功標準：在大鼠清醒后用Bederson評分分級法觀察其神經行為學變化。評分≥2分說明造模成功，則納入本實驗。Bederson評分觀察內容包括提鼠尾、前肢屈曲、移動時阻力、肌張力、轉圈等，每項神經損傷癥狀分為0～4個功能等級，滿分為11分，分數越高，表示動物神經行為障礙越嚴重[8]。

1.5 分組與給藥 將造模成功后的大鼠按隨機數字表隨機分為6組，每組10只，即模型對照組，尼莫地平片對照組，天麻鉤藤顆粒對照組，桑芪首烏片高、中、低劑量組，另加上假手術對照組（10只），共計7組。造模后24 h內開始第1次給藥。桑芪首烏片高、中、低劑量組給予桑芪首烏片（生藥劑量分別為2.8、1.4、0.7 g/kg，相當于成人等效劑量20、10、5倍）雙蒸水溶液灌胃；尼莫地平片對照組給予尼莫地平片（劑量為7.7 mg/kg）雙蒸水溶液灌胃；天麻鉤藤顆粒對照組給予天麻鉤藤顆粒（劑量為2.0 g/kg）雙蒸水溶液灌胃；模型對照組和假手術對照組給予等體積雙蒸水灌胃。容量按1.0 mL/100 g（體質量）計，每天1次，連續6周。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 標本的取樣 實驗結束，即第6周后，禁食12 h，將大鼠用100 g/L水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉后迅速從后頸處斷頭處死，逐層分離，取出大腦，放入40 g/L多聚甲醛中，4℃保存。石蠟切片前切成2～3 mm厚的小塊并在不同酒精濃度下脫水。后放入二甲苯2次，65℃浸蠟，室溫冷卻后切片。

1.6.2 神經行為學評分 采用Bederson評分分級法。于術后當日，術后第3、6周分別對各組大鼠進行神經行為學評分并記錄結果。

1.6.3 SABC免疫組織化學法檢測大鼠腦組織BDNF、TrkB表達 主要操作步驟：石蠟包埋的切片經pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）浸洗3次，加入過氧化氫室溫孵育15 min，pH7.4 PBS浸洗2遍。加入Ultra V block試劑室溫孵育5 min，pH7.4 PBS浸洗3次。加入1∶500稀釋的小鼠抗人一抗抗體，4℃孵育過夜，pH7.4 PBS浸洗3次。加入生物素標記的二抗室溫孵育20 min，pH7.4 PBS浸洗4次。加入鏈霉親和素—過氧化物酶室溫孵育20 min，pH7.4 PBS浸洗4次。DAB顯色。顯微鏡觀察并拍照。在顯微鏡的目鏡（×200）下，每張切片選3個視野，觀察陽性細胞數目。BDNF、TrkB陽性表達均顯示為細胞核內呈棕黃色樣染色。

1.7 統計方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。所有數據均以均數±標準差(-x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析。方差齊時，組間兩兩比較采用LSD統計方法；若方差不齊時，組間兩兩比較采用Dunnett's T3法檢驗。以Ρ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經行為學評分比較 表1結果顯示：假手術對照組大鼠在整個實驗過程中均未出現神經行為異常表現，評分均為0分。動物模型復制完成后，與假手術對照組比較，模型對照組神經行為學評分明顯增高（P＜0.05）；與模型對照組比較，桑芪首烏片高、中、低劑量組，天麻鉤藤顆粒對照組及尼莫地平片對照組神經行為學評分無明顯差別（P＞0.05）。給藥3周后，與假手術對照組比較，模型對照組神經行為學評分明顯增高（P＜0.05）；與模型對照組比較，桑芪首烏片高、中劑量組，天麻鉤藤顆粒對照組及尼莫地平片對照組神經行為學評分明顯降低（P＜0.05）。給藥6周后，與假手術對照組比較，模型對照組神經行為學評分進一步增高（P＜0.05）；與模型對照組比較，桑芪首烏片高、中劑量組，天麻鉤藤顆粒對照組及尼莫地平片對照組神經行為學評分明顯降低（P ＜ 0.05）。

表1 各組大鼠神經行為學評分比較Table 1 Comparison of the neurobehavioral scores in various groups （-x±s，s/分）

2.2 各組大鼠腦組織BDNF和TrkB表達水平比較 圖1、2，表2結果顯示：與假手術組比較，模型對照組腦組織BDNF、TrkB表達陽性細胞數均增加，其中：BDNF表達陽性細胞數明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05），TrkB表達陽性細胞數增加，差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型對照組比較，桑芪首烏片高、中、低劑量組BDNF、TrkB表達陽性細胞數明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

圖1 各組大鼠腦組織BDNF表達比較（免疫組織化學法，×200）Figure 1 Comparison of the expression of BDNF in various groups（by immunohistochemical method，×200）

圖2 各組大鼠腦組織TrkB表達比較（免疫組織化學法，×200）Figure 2 Comparison of the expression of TrkB in various groups（by immunohistochemical method，×200）

表2 各組大鼠腦組織BDNF及TrkB表達的比較Table 2 Comparison of the expression of BDNF and TrkB in various groups （-x±s，n/個）

腦梗死后導致腦神經損傷的過程是一個多環節、多因素、多途徑的復雜過程。神經保護劑的研發成為當前治療腦梗死的難點。中醫藥在改善腦缺血再灌注損傷方面有明顯的優勢[9-14]。

本課題組在前期臨床應用中發現桑芪首烏方對缺血性腦卒中患者的中醫證候、偏癱肢體的運動功能有明顯的改善作用，其中醫證候療效總有效率為85.29%，優于對照組的66.67%，差異有統計學意義（P＜0.05）[2]。桑芪首烏方方中：制首烏，味苦、甘，性微溫，歸肝腎經，善補肝腎、益精血；桑寄生味苦、性平，歸肝腎經，可益肝腎、強筋骨，偏走于肢體筋脈。配伍黃芪等中藥以益氣活血化瘀。諸藥合用，肝腎得補，精血得旺，髓海得充，瘀去絡通，且滋補而不留邪，降瀉而不傷正，補中有瀉，寓瀉于補。

BDNF及其受體TrkB在腦梗死損傷修復中的作用已逐漸得到肯定。BDNF是神經營養素家族的重要一員，在腦內廣泛分布，尤以海馬和皮層含量最高[15]。BDNF可促進多種神經元的存活和生長發育，提高神經元的生物活性，減少損傷后神經元的自然死亡，還能促進突觸的可塑性，改變腦內神經元的形態，增加突觸終末的密度和促進樹突、軸突的生長。BDNF發揮生物學效應主要有賴于和其特異性受體TrkB的結合[16-18]。BDNF在海馬、大腦皮質的神經元和神經膠質細胞內合成、分泌，經逆行運輸到基底前腦膽堿能神經元的胞體，然后作用于膽堿能投射纖維終末的受體TrkB，形成配—受體復合物，后者迅速激活TrkB[19]。當BDNF與TrkB結合后，受體細胞外區構象變化，使受體細胞內區的酪氨酸激酶活性增強。BDNF可通過提高神經元表面的BDNF受體TrkB的表達，對神經元產生生物效應，還可以通過活化BDNF受體TrkB，在細胞內阻斷損傷因子的作用[20-21]，從而保護神經元免受缺血性損傷，縮小梗死體積，促進損傷后神經組織的修復，減輕和改善患者癥狀。

本研究結果顯示：與模型對照組比較，桑芪首烏片高、中、低劑量組大鼠給藥3周后的神經行為評分明顯降低，腦組織BDNF、TrkB陽性細胞數量明顯增加，均呈劑量依賴性。表明桑芪首烏片對腦缺血再灌注大鼠的神經細胞有保護作用，對腦梗死后的神經功能康復有促進作用。

綜上所述，桑芪首烏片具有神經保護作用，其機制可能與上調腦缺血再灌注大鼠腦組織BDNF、TrkB的表達有關。