射干麻黃湯對哮喘性肺炎大鼠肺部炎癥反應及免疫反應的影響

陳豪， 陳軍紅， 沈旭波， 呂可君

（1.永康市第一人民醫院，浙江永康 321300；2.上海市岳陽醫院腫瘤科，上海 310000）

哮喘又名支氣管哮喘，是一種由嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、肥大細胞、中性粒細胞等炎癥細胞和細胞成分參與的慢性氣道炎癥發展而來嚴重影響人類健康的慢性炎癥性呼吸系統疾病[1]。其發病率逐年上升，雖然醫學者們已經做了諸多努力來提高治療效果，但其仍無法治愈，給世界各國的公共衛生帶來了沉重的負擔[2]。世界衛生組織發起以每年5月的第1個星期二為世界哮喘日，用來提醒公眾對該病的認識并加強該病的預防和治療[3]。射干麻黃湯出自《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”，是內科治療呼吸系統疾病常用的方劑[4]。已有大量臨床研究[5-6]表明，中藥射干麻黃湯治療支氣管哮喘療效確切，具有遠期療效穩定、不良反應少、毒副作用罕見等特點，但其具體作用機制尚不明確。本研究主要探討射干麻黃湯對哮喘性肺炎大鼠肺部炎癥反應及免疫反應的影響，以期為哮喘病的臨床應用提供參考數據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 6周齡SPF級健康雄性SD大鼠120只，體質量190～200 g，購自浙江省醫學科學院，動物質量合格證號：SYXK（浙）2017-0010。于浙江省醫學科學院進行動物飼養，室溫24～25℃，濕度45%～55%。

1.2 藥物及給藥劑量 射干麻黃湯由射干9 g、麻黃12 g、生姜12 g、細辛9 g、紫菀9 g、款冬花9 g、大棗7枚、半夏9 g、五味子3 g、甘草3 g組成，水煎劑（生藥量2.0 g/mL）由永康市中醫院中藥房提供。參照文獻[7]與魏偉主編的《藥理實驗方法學》[8]，根據成人標準體質量60 kg的臨床每日常用劑量（1付）計算成人用藥劑量（1.2 g/kg），按大鼠每日等效灌胃劑量為人類的9倍，確定大鼠灌胃低劑量為9倍等效人體劑量（10.0 g/kg），中劑量組為18倍等效人體劑量（20.0 g/kg），高劑量組為36倍等效人體劑量（40.0 g/kg）。地塞米松片購自上海信宜制藥股份有限公司，0.75 mg/片，批號：17021512。

1.3 試劑與儀器 雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購自美國Sigma公司；白細胞介素（IL）-4、IL-13和腫瘤壞死因子（TNF-α）的酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒購自上海通蔚實業有限公司；抗CD4-FITC、抗CD25-PC5、抗CD28-FITC、IgG1-FITC、IgG1-PE購自北京義翹神州科技有限公司；抗胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）抗體、Toll樣受體4（TLR4）抗體、核因子κB（NF-κB）抗體、HPR標記的山羊抗小鼠IgG抗體購自艾博抗（上海）貿易有限公司。402型超聲霧化器（上海四菱醫療器械廠）；CytoFLEX LX流式細胞儀（中國貝克曼庫爾特商貿有限公司）；普朗DNM-9602G酶標儀（濟南百源醫療設備有限公司）；美國Bio-Rad伯樂Gel DocTM XP凝膠成像系統（上海巴玖設備有限公司）。

1.4 造模方法 參考文獻[9]的OVA激發方法復制哮喘性肺炎大鼠模型。在實驗第1天和第8天，100只SD大鼠腹腔注射含10%液態鋁10 g/L的OVA混懸液2 mL，14 d后用超聲霧化的1%OVA液激發，每次30 min，共4周。將其余20只SD大鼠設為空白組，用生理鹽水代替OVA混懸液，步驟同上。以大鼠出現呼吸急促、喘息、雙肺聞及哮鳴音、躁動，甚至出現口唇、耳紫紺等表現視為造模成功。

1.5 分組、給藥及取材 實驗設置6組，即空白組，模型組，地塞米松組，中藥低、中、高劑量組，每組20只大鼠。至激發第3周周一開始，每天上午繼續霧化OVA液，下午給予藥物處理。空白組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃；地塞米松組給予劑量為1.0 mg·kg-1·d-1的地塞米松溶液灌胃；中藥低、中、高劑量組給予射干麻黃湯（劑量分別為 10.0、20.0、40.0 g·kg-1·d-1）灌胃。每天1次，共計14 d。取材：給藥結束后，將大鼠麻醉后，采血，頸椎脫臼法處死動物，取肺。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 觀察大鼠一般狀態 在實驗過程中觀察大鼠死亡情況以及活動狀態。

1.6.2 蘇木素—伊紅（HE）染色觀察肺組織病理 取肺固定后，常規石蠟切片，然后按照HE染色液說明書進行染色：先將切片脫蠟、水洗、蘇木素染色、水洗，再用1%鹽酸酒精分化、水洗，0.6%氨水返藍、水洗，0.5%伊紅液染色、水洗，再脫水、二甲苯透明。最后用中性樹膠封片，在400倍顯微鏡下觀察。

1.6.3 稱質量法測定肺組織濕干質量比 取新鮮右肺中葉稱濕質量，然后置于80℃恒溫烤箱烘烤至恒質量，再稱干質量。肺組織濕干質量比=肺濕質量/肺干質量。

1.6.4 牛鮑氏計數板計算血液中白細胞數目 取抗凝血0.5 mL牛鮑氏計數板進行白細胞計數，計算血液中白細胞數量。

1.6.5 ELISA法檢測肺組織勻漿中炎癥因子IL-4、IL-13、TNF-α含量 按照ELISA試劑盒說明操作：將樣品加入各反應孔，37℃反應45 min。后用洗滌液洗滌4次，加入生物素標記的抗體，在37℃孵育30 min。再洗滌后加鏈霉親和素-HRP混合均勻，在37℃反應30 min。最后加入顯色劑避光顯色，加終止液終止反應。應用酶標儀檢測450 nm處吸光度（OD，D），計算樣本中濃度。

1.6.6 流式細胞術檢測血液中CD4+CD25+、CD8+CD28-細胞所占比例 取100μL血液于流式管中，加入相應的抗體10μL，混合后于室溫下避光孵育20 min，再加入2 mL紅細胞裂解液，溶解紅細胞10 min，以1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。最后將其懸浮于0.3 mL PBS溶液中并加入1%多聚甲醛，上流式細胞儀檢測。

1.6.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測肺組織TSLP、TLR4和NF-κB表達 將肺組織研磨成勻漿，并用RIPA裂解液提取總蛋白，再用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉—聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉蛋白，隨后加入對應的一抗（TSLP抗體1∶1 000、TLR4抗體1∶500、NF-κB抗體1∶1 000）于4℃封閉過夜。第2天加入對應HPR標記的山羊抗小鼠IgG抗體室溫封閉，最后應用增強化學發光（ECL）試劑顯色，曝光。由Bio-Rad凝膠Doc EZ成像儀拍攝，以GAPDH為內參，利用Image J軟件分析目標蛋白帶的灰度值比值（p）。

1.7 統計方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(-x±s)表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進一步兩兩比較采用Student-Newman-Keul Test檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀態 在造模和給藥過程中各組大鼠均無死亡。空白組大鼠活動正常；模型組大鼠開始出現頻繁抓耳撓腮、上躥下跳，后期扎堆蜷縮、精神萎靡、呼吸短促、毛發豎立，可見口唇紫紺、伸頸縮胸收腹等明顯喘息表現；而隨著給藥時間和藥量的積累，地塞米松組和中藥組大鼠上述癥狀明顯減輕。

2.2 射干麻黃湯減輕哮喘性肺炎大鼠肺組織病理改變 圖1結果顯示：模型組肺組織可見大量炎癥細胞的浸潤，并存在肺泡與間質充血、水腫；而地塞米松組和中藥各劑量組肺組織炎癥細胞的浸潤、肺泡與間質充血水腫等癥狀較模型組明顯減輕，且隨著射干麻黃湯給藥量的增加病癥程度明顯減輕。表明射干麻黃湯可呈劑量依賴性減輕哮喘性肺炎大鼠肺組織病理改變。

圖1 各組大鼠肺組織病理情況比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the pathological features of rat lung tissue in various groups（HE staining，×400）

2.3 射干麻黃湯減輕哮喘性肺炎大鼠肺水腫 圖2結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠肺濕干質量比明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。該結果是表明模型構建成功的指標之一，也說明哮喘性肺炎大鼠存在肺水腫現象。與模型組比較，地塞米松組和中藥各劑量組大鼠肺濕干質量比明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.01），這表明地塞米松和射干麻黃湯能減輕哮喘性肺炎大鼠的肺水腫現象。另外，中藥組大鼠的肺濕干質量比隨著給藥量的增加而逐漸減小，表明射干麻黃湯可呈劑量依賴性減輕哮喘性肺炎大鼠的肺水腫現象。

圖2 各組大鼠肺濕干質量比比較Figure 2 Comparison of the rat lung dry-to-wet mass ratio in various groups(-x±s)

2.4 射干麻黃湯減輕哮喘性肺炎大鼠炎癥反應 圖3-A結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血液中白細胞數量明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01）。該結果是模型構建成功的標志之一，也說明哮喘性肺炎大鼠存在炎癥反應。與模型組比較，地塞米松組和中藥各劑量組大鼠血液中白細胞數量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01），這表明地塞米松和射干麻黃湯能減輕哮喘性肺炎大鼠的炎癥反應。中藥組大鼠血液中白細胞數量隨給藥劑量的增加而逐漸減少，這說明射干麻黃湯可呈劑量依賴性減輕哮喘性肺炎大鼠的炎癥反應。

圖3 各組大鼠炎癥反應比較Figure 3 Comparison of the inflammatory response in rats of various groups(-x±s)

圖3 -B結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠肺組織勻漿中炎癥因子IL-4、IL-13和TNF-α含量增加，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。該結果是表明模型構建成功的指標之一，也說明哮喘性肺炎大鼠肺部存在炎癥反應。與模型組比較，地塞米松組和中藥各劑量組大鼠肺組織勻漿中炎癥因子IL-4、IL-13和TNF-α含量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），這說明地塞米松和射干麻黃湯能減輕哮喘性肺炎大鼠的炎癥反應。中藥組大鼠肺組織勻漿中炎癥因子IL-4、IL-13和TNF-α含量隨給藥劑量的增加而逐漸減少，這說明射干麻黃湯可呈劑量依賴性減輕哮喘性肺炎大鼠的炎癥反應。

2.5 射干麻黃湯增強哮喘性肺炎大鼠免疫反應 圖4結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-細胞所占比例明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01），該結果是表明模型構建成功的指標之一，也說明哮喘性肺炎大鼠免疫反應減弱。與模型組比較，地塞米松組和中藥各劑量組大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-細胞所占比例明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01），這說明地塞米松和射干麻黃湯能增強哮喘性肺炎大鼠的免疫反應。中藥組大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-細胞所占比例隨給藥劑量的增加而逐漸增加，這說明射干麻黃湯可呈劑量依賴性增強哮喘性肺炎大鼠的免疫反應。

2.6 射干麻黃湯降低哮喘性肺炎大鼠肺組織TSLP、TLR4和NF-κB表達 圖5結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠肺組織TSLP、TLR4和NF-κB表達量明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.01），該結果是表明模型構建成功的指標之一。與模型組比較，地塞米松組和中藥各劑量組TSLP、TLR4和NF-κB表達量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01），且中藥組TSLP、TLR4和NF-κB表達量隨給藥量的增加而逐漸減少，這說明射干麻黃湯可呈劑量依賴性抑制哮喘性肺炎大鼠肺組織TSLP、TLR4和NF-κB表達。

3 討論

圖4 各組大鼠血液中CD4+CD25+與CD8+CD28-細胞比例比較Figure 4 Comparison of the percentage of CD4+CD25+and CD8+CD28-cells in various groups(-x±s)

哮喘作為一個高度流行的慢性氣道疾病，嚴重影響著各個年齡段人群的健康問題，其發病率和死亡率一直在快速增長[10]。關于哮喘的發病機理，中醫學有“初病在肺，久病在腎”的說法[11]，因此，在哮喘發病過程中，肺部健康是關鍵。本研究通過HE染色和測定肺組織濕干質量比發現，哮喘大鼠肺組織存在大量炎癥細胞浸潤，并存在肺泡與間質充血、水腫，而射干麻黃湯可呈劑量依賴性減輕哮喘性肺炎大鼠的這些癥狀。

圖5 各組大鼠肺組織TSLP、TLR4和NF-κB表達比較Figure 5 Comparison of the expression levels of TSLP，TLR4 and NF-κB in rat lung tissue of various groups(-x±s)

哮喘是一種以氣道炎癥、黏液高分泌和氣道高反應性為特征，與多種炎癥介質、細胞因子和黏附分子的產生增加密切相關的疾病[10]。炎癥反應的最明顯標志就是發熱和血液中白細胞數目的增多。本研究通過牛鮑氏計數板計算血液中白細胞數目發現，哮喘大鼠血液中白細胞數量明顯增多，射干麻黃湯可呈劑量依賴性減少哮喘性肺炎大鼠血液中白細胞數目，說明射干麻黃湯可減輕大鼠炎癥反應。在哮喘的發病過程中，肺部炎癥反應是致病關鍵，炎癥因子IL-4、IL-13和TNF-α在過敏性肺部炎癥中發揮重要作用[12]。本研究通過ELISA法檢測肺組織勻漿中炎癥因子IL-4、IL-13和TNF-α含量發現，射干麻黃湯可呈劑量依賴性減少哮喘性肺炎大鼠的肺部組織中炎癥因子IL-4、IL-13和TNF-α含量，從而減輕肺部炎癥。

支氣管哮喘的反復發作是由于免疫調節紊亂，T淋巴細胞被抗原激活成效應T細胞是哮喘免疫反應中的關鍵步驟之一。CD4+CD25+及CD8+CD28-T淋巴細胞是一類調節性T細胞，參與自身免疫調節，在維持自身免疫耐受中發揮了重要作用[13]。CD4+CD25+細胞主要通過直接接觸抑制效應T淋巴細胞活化、增殖及殺傷毒性作用，從而與其他細胞接觸發揮免疫調節作用，其數量異常會導致各種嚴重的超敏反應和自身免疫反應，如哮喘、過敏反應等[14]。近年來已證實CD8+C28-細胞是另一種重要的調節性細胞，這種細胞可通過上調抗原遞呈細胞表面抑制受體（如ILT3、ILT4等）的表達來實現免疫抑制功能[15]。本研究通過流式細胞術檢測大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-細胞數量發現，哮喘大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-細胞所占比例明顯減少，射干麻黃湯可呈劑量依賴性增多哮喘肺炎大鼠血液中CD4+CD25+和CD8+CD28-細胞所占比例，從而增強哮喘性肺炎大鼠的免疫反應。

哮喘發病機制的重要環節之一就是Th1細胞的細胞因子不足和Th2細胞分泌的細胞因子增多[16]。近年來諸多研究顯示，胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）可促進Th2型免疫反應，從而引發哮喘或其他過敏性疾病[17]。有研究[18-19]報道，CD4+T細胞可以直接對TSLP反應，而TSLP可促進CD4+T細胞向Th2性細胞分化，同時TSLP激活的樹突狀細胞與CD8+T細胞作用后，能夠促進其增殖分化為表達IL-4和IL-13的效應細胞。因此，增加TSLP表達可使體內Th2型細胞因子產生增加，從而推動Th2型免疫應答[20]。本研究通過Western Blot法檢測各組大鼠肺組織TSLP表達的結果可知，哮喘大鼠肺組織TSLP表達明顯增多，射干麻黃湯可呈劑量依賴性減輕哮喘性肺炎大鼠肺組織TSLP表達，從而減輕Th2型細胞因子產生來減輕哮喘。Toll樣受體4是一種重要的免疫模式識別受體，在包括巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞在內的免疫細胞上高度表達，控制先天和適應性免疫應答，同時介導樹突狀細胞的成熟、釋放白細胞介素，促進細胞因子的合成和釋放，促進炎癥反應的產生[21]。因此，其在氣道炎癥的發生和調節中發揮重要作用[22]。本研究通過Western Blot法檢測肺組織TLR4表達的結果可知，哮喘大鼠肺組織TLR4表達明顯增多，射干麻黃湯可呈劑量依賴性減輕哮喘性肺炎大鼠的TLR4表達，從而減輕炎癥反應。NF-κB位于下游TLR4信號通路，在調節免疫應答、細胞增殖和分化方面處于關鍵地位，是免疫調節過程的重要組成部分[23]。NF-κB能夠啟動炎癥介質相關基因轉錄，并通過髓系分化蛋白促進炎癥因子的產生[24]。本研究通過Western Blot檢測法肺組織NF-κB表達可知，哮喘大鼠肺組織NF-κB表達明顯增多，射干麻黃湯可呈劑量依賴性降低哮喘性肺炎大鼠的NF-κB表達，從而減輕炎癥反應。

綜上所述，射干麻黃湯呈劑量依賴性減輕哮喘肺炎大鼠的肺部病理損傷、炎癥反應，增強免疫效應，并下調肺組織TSLP、TLR4和NF-κB的表達，證實射干麻黃湯可以有效減輕哮喘，提示其可作為過敏性哮喘的治療藥物，為哮喘的治療提供了參考數據。