消癌解毒方對結直腸癌細胞增殖的抑制作用及其機制研究

譚佳妮 ， 劉文豪 ， 沈衛星 ， 程海波

（1.南京中醫藥大學轉化醫學研究中心，國家中醫藥管理局名醫驗方評價與轉化重點實驗室，江蘇省抗腫瘤驗方與產業化工程實驗室，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心，江蘇南京 210023）

結直腸癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，其發病率在全球男性和女性惡性腫瘤類型中分別列第2位和第3位[1]，死亡率居第2位[2]，結直腸癌晚期重要臟器轉移是其主要的死亡原因。在我國，結直腸癌的發病率及死亡率逐年上升，其發病速度為世界平均速度的2倍[3-4]。中醫藥在結直腸的預防與治療中扮演著越來越重要的角色，從中醫藥中發掘有效的預防結直腸癌的靶點及藥物已是近年的研究重點。消癌解毒方是國醫大師周仲瑛教授結合多年的臨床實踐形成的臨床有效驗方，該方由白花蛇舌草、半枝蓮、山慈菇、莪術、太子參、麥冬等組成，具有清熱散結、消癌解毒，化痰祛瘀、益氣養陰、扶正抗癌的功效。既往關于消癌解毒方的臨床與實驗研究發現，其對胃癌、食管癌、結直腸癌等多種消化道腫瘤具有確切療效，可以提高患者抗腫瘤的免疫功能，與西醫常規惡性腫瘤治療方案比較，聯合用藥在改善中晚期惡性腫瘤患者生命質量與緩解中醫癥狀方面具有明顯的效果[5-7]。本研究在前期臨床效應基礎上，體外觀察了消癌解毒方含藥血清抑制結直腸癌細胞增殖的作用，從細胞周期改變的角度探討其作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養 人結直腸癌HT-29、HCT-116、LoVo細胞株均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。人結直腸癌HT-29、HCT-116、LoVo細胞株用RPMI 1640完全培養基（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素）于37℃5%CO2的培養箱中常規培養，取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2 藥物及制備 消癌解毒方組成中藥材均購自亳州國苑中藥材飲片有限公司，經南京中醫藥大學鄒立思教授鑒定為道地藥材。于南京中醫藥大學藥理教研室煎制：稱取復方中各藥材后，加入10倍藥量的水，煎煮2次（分別為2、1.5 h），收集、合并2次濾液，減壓濃縮至適當體積，最終成2 g/mL濃度的濾液，于4℃保存備用。

1.3 試劑與儀器 CyclinA2、CyclinB1、CDK1、P21、P27、Notch1、Hes1等抗體（美國Abcam公司）；ECL檢測試劑盒（美國Thermo公司）。FACSCantoTM流式細胞儀（美國BD公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ProwerPacTMBasic凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Tanon-5500化學發光凝膠成像儀（天能科技有限公司）。

1.4 實驗動物及含藥血清制備 清潔級雄性新西蘭兔2.0～2.2 kg，購于南京市江寧區青龍山動物繁殖場。動物質量合格證號：SCXK（蘇）2012-0008。將兔隨機分為對照組、給藥組，每組2只。給藥組給予消癌解毒方煎液灌胃，劑量為40 g/kg（為臨床給藥劑量的5倍），每日分2次灌服；對照組給予灌服等體積生理鹽水。2組均連續灌胃5 d，末次給藥前12 h禁食不禁水。給藥2 h后，異氟烷麻醉，頸總動脈取血。室溫靜置30 min后以3 000 r/min離心5 min分離血清，合并同組血清，56℃滅活30 min，0.22μmol/L微孔濾膜除菌，放置于-80℃冰箱中保存備用。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 細胞增殖檢測 取對數生長期結直腸癌細胞，調整細胞密度為104個/mL加入96孔板中，100μL/孔，置于體積分數5%CO2孵箱中。24 h棄掉培養上清后，加入體積分數5%、10%、15%的消癌解毒方含藥血清100μL/孔。設6個復孔，繼續培養48 h。干預結束后，每孔加入10μL細胞計數試劑盒8（CCK-8）溶液繼續培養4 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度（OD，D）值。根據D值計算各含藥血清對細胞增殖的抑制作用。

1.5.2 細胞形態觀察 對數生長期結直腸癌細胞貼壁后培養至細胞融合80%～90%時，分別加入5%、10%、15%消癌解毒方含藥血清，孵育48 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態的變化。

1.5.3 細胞周期檢測 取對數生長期結直腸癌細胞，調整細胞密度為104個/mL加入96孔板中，1 mL/孔，置于37℃體積分數5%CO2孵箱中。24 h后棄掉培養上清，加入體積分數5%、10%、15%的消癌解毒方含藥血清2 mL/孔。設3個復孔，繼續培養48 h。給藥結束后，胰酶消化收集細胞并計數，加入1 mL預冷的體積分數70%乙醇中4℃固定過夜，以1 000 r/min離心5 min后用1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，離心棄上清后加入500μL染色液[25μL碘化丙啶（PI）染色液+10μL RNase]37℃避光孵育30 min，應用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況，用Kaluza Analysis軟件進行細胞DNA含量及光散射分析。

1.5.4 細胞周期相關蛋白CyclinA2、CyclinB1、CDK1、P21、P27及Notch1/Hes1信號途徑相關蛋白Notch1、Hes1表達的檢測 采用蛋白免疫印跡（Western Blot）法。對數生長期結直腸癌細胞貼壁后培養至細胞融合80%～90%時，分別加入5%、10%、15%消癌解毒方含藥血清，孵育48 h后，收集空白組細胞及處理后的細胞，用Western及IP裂解液裂解細胞提取蛋白。用BCA法定量蛋白，調整蛋白濃度后置于95℃金屬浴中變性10 min。10%～12%分離膠和5%濃縮膠十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。濕轉轉膜將蛋白轉至PVDF膜上，100 g/L脫脂牛奶37 ℃封閉2 h。一抗（CyclinA2，1∶2 000； CyclinB1，1∶2 000；CDK1，1∶2 000；P21，1∶2 000；P27，1∶1 000；Notch1，1∶1 000；Hes1，1∶1 000）4 ℃孵育過夜。次日，PBST洗膜3次后，室溫孵育二抗1 h，最后應用增強型化學發光（ECL）試劑進行顯色，應用GelAnalysis軟件進行條帶分析。

1.6 統計方法 應用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理，實驗數據以均數±標準差(-x±s)表示，采用單因素方差分析和t檢驗比較各組差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 消癌解毒方含藥血清對結直腸癌細胞增殖的影響 表1關于CCK-8實驗的結果顯示，消癌解毒方含藥血清處理人結腸癌HT-29、HCT-116、LoVo細胞48 h后，HT-29、HCT-116及LoVo細胞的存活率均有不同程度的降低，且該抑制作用隨著含藥血清濃度的增大而增強。15%含藥血清對HT-29、HCT-116及LoVo細胞增殖的抑制作用分別為（37.64±1.62）%、（58.69±2.68）%及（38.54±2.95）%。可見，HCT-116細胞對含藥血清最敏感。因此，我們選擇HCT-116細胞為研究對象，進行下一步的實驗研究。

2.2 消癌解毒方含藥血清對結直腸癌細胞形態的影響 倒置光學顯微鏡下觀察給予含藥血清后HCT-116細胞形態的變化，結果如圖1所示：正常HCT-116細胞呈梭形，細胞伸展，呈密集型或重疊生長；給予含藥血清后，細胞呈現出不規則的形狀、核裂碎、胞膜皺縮、間距變大。隨著含藥血清濃度的增加，細胞形態改變的情況越明顯。

表1 消癌解毒方含藥血清對結直腸癌細胞增殖的影響Table 1 The effect of CTR-containing serum on the proliferation of colorectal cancer cells （-x±s，n=6）

2.3 消癌解毒方含藥血清對結直腸癌細胞周期的影響 PI可以與細胞內的DNA及RNA結合，通過流式細胞技術檢測到的與DNA結合的PI的熒光強度即可反應細胞內DNA含量。細胞周期的各個時期DNA含量是不同的，因此通過PI染色法對細胞內的DNA進行檢測就可以將細胞周期的各時相區分開來。給予含藥血清處理后，HCT-116細胞周期分布情況如圖2、表2所示：與空白對照組比較，G2/M期細胞數隨含藥血清濃度增加而增加（P＜0.01），S和G0/G1期細胞數減少，S期尤其明顯（P＜0.05或P＜0.01）。提示消癌解毒方含藥血清能劑量相關性地誘導HCT-116細胞發生G2/M期阻滯。

圖1 消癌解毒方含藥血清對結直腸癌HCT-116細胞形態的影響（×200）Figure 1 The effect of CTR-containing serum on the morphological features of HCT-116 colorectal cancer cells（×200）

2.4 消癌解毒方含藥血清對結直腸癌細胞周期相關蛋白表達及Notch1信號通路的影響 采用Western Blot法檢測消癌解毒方含藥血清對G2/M期周期相關蛋白以及周期依賴性蛋白激酶抑制劑表達的影響，結果如圖3、表3所示，消癌解毒方含藥血清能明顯下調CDK1、CyclinA2、CyclinB1等促進細胞周期的蛋白并上調P21、P27等抑制周期進程的蛋白。同時，我們檢測了給予含藥血清后的HCT-116細胞內Notch1信號通路蛋白水平的變化，結果如圖3、表3所示，隨含藥血清劑量的增加，Notch1及Hes1蛋白表達逐漸減少。提示消癌解毒方含藥血清可能通過抑制Notch1/Hes1通路抑制周期相關性蛋白的表達而發揮調節細胞周期的作用。

圖2 消癌解毒方含藥血清對結直腸癌HCT-116細胞周期分布的影響Figure 2 The effect of CTR-containing serum on the cell cycle distribution of HCT-116 colorectal cancer cells

表2 消癌解毒方含藥血清對結直腸癌HCT-116細胞周期分布的影響Table 2 The effect of CTR-containing serum on the cell cycle distribution of HCT-116 colorectal cancer cells （-x±s，n=3）

3 討論

中醫學認為，結直腸癌（大腸癌）是在脾氣虧虛的基礎上，因外感濕邪、飲食不節、情志失調等內外多種因素的誘導而生成癌毒，與濕、熱、瘀等病理因素交雜復合，搏結于腸道，傷及腸腑，形成癌腫，導致腸腑通降失司的病變。因此，結直腸癌的基本病機是濕熱瘀毒、脾氣虧虛。消癌解毒方是國醫大師周仲瑛教授結合多年的臨床實踐形成的有效驗方。方中：白花蛇舌草、半枝蓮為君藥，清熱散結、消癌解毒；山慈菇、莪術為臣藥，化痰祛瘀、消腫散結；太子參、麥冬為佐使，益氣養陰、扶正抗癌。我們的前期實驗研究發現：在體內，消癌解毒方通過誘導腫瘤細胞凋亡顯著抑結直腸癌CT-26細胞荷瘤小鼠腫瘤的增殖[8-9]；在體外，消癌解毒方含藥血清抑制結腸癌細胞糖酵解過程抑制腫瘤細胞增殖[10]，但尚缺乏相關機制的深入研究。本研究發現，隨著消癌解毒方含藥血清濃度的增加，HCT-116細胞增殖活性顯著下降。流式細胞儀結果顯示，消癌解毒方含藥血清增加了HCT-116細胞G2/M期比例，降低了G0/G1及S期細胞比例，使結直腸細胞HCT-116阻滯于G2/M期。表明消癌解毒方抑制HCT-116細胞增殖的機制可能與其調控細胞周期有關。

圖3 消癌解毒方含藥血清對細胞周期蛋白及Notch1通路相關蛋白表達的影響Figure 3 The effect of CTR-containing serum on the expression of cell cycle related proteins and Notch1 pathway related proteins

Notch1在結直腸癌組織中高表達，在結直腸癌形成過程中具有致癌基因作用[11]，且在腫瘤組織中的高表達與化療耐藥及腫瘤的侵襲轉移有關[12-13]。Notch1信號分子對細胞的分化、增殖和凋亡有廣泛的調控作用。Edelmann等報道，Notch1轉錄調節參與慢性淋巴細胞白血病細胞周期調控[14]。此外，在肝癌等的進展過程中，Notch信號通路還參與了肝癌細胞周期的調控[15]。本實驗應用Western Blot檢測了周期相關蛋白及Notch1通路相關蛋白表達的變化，結果顯示消癌解毒方含藥血清通過抑制Notch1/Hes1信號通路，增加了HCT-116細胞G2/M期比例，使結直腸細胞阻滯于G2/M期從而發揮其抑制腫瘤細胞增殖的作用，進一步明確了消癌解毒方抑制結直腸癌細胞增殖的作用機制。本研究可為消癌解毒方的臨床開發與應用奠定理論和實踐基礎。

表3 消癌解毒方含藥血清對細胞周期蛋白及Notch1通路相關蛋白相對表達的影響Table 3 The effect of CTR-containing serum on the relative expression of cell cycle related proteins and Notch1 pathway related proteins （-x±s，n=3，p）