扶正抗癌方通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白促肺癌細(xì)胞凋亡

李文娟， 王蘇美

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州康大職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 511356；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)院腫瘤科，廣東廣州 510120）

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。在我國，肺癌是男性發(fā)病率最高的癌癥（22.14%），也是所有最終導(dǎo)致死亡的癌癥中的首要原因，其中男性（27.21%）、女性（21.91%）[2]。盡管聯(lián)合治療取得了重大進(jìn)展，但非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的預(yù)后仍然很差，所有分期和亞型合并的5年生存率仍然低至11%[3]。中醫(yī)藥（Chinese herbal medicine，CHM）為晚期肺癌患者提供了很好的輔助治療方法[4-5]，由于其療效顯著、耐藥率低、毒性較小而引起了人們的廣泛關(guān)注。

扶正抗癌方由廣東省中醫(yī)院吳萬垠教授首創(chuàng)，用于非小細(xì)胞肺癌的治療已有10多年的歷史，療效顯著。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方和吉非替尼聯(lián)合用藥與單獨(dú)使用吉非替尼相比，具有更長的無進(jìn)展生存期（PFS）以及更小的毒性[6]。同時(shí)，扶正抗癌方可以提高NSCLC患者的疾病控制率（DCR）和中位生存期（MST）[7-8]。在分子機(jī)制上，扶正抗癌方可通過活化蛋白激酶（AMPKα）介導(dǎo)的胰島素樣生長因子（IGF）與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 1（IGFBP1）以及叉頭框蛋白 O3a（FOXO3a）的誘導(dǎo)和相互作用抑制NSCLC細(xì)胞的增長，亦證明了其對肺癌具有一定的治療效果[9]。本課題組近期的研究還發(fā)現(xiàn)扶正抗癌方可通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）介導(dǎo)的對核因子κB（NF-κB）p65的抑制減少細(xì)胞表面相關(guān)蛋白（MUC1）的表達(dá)，從而抑制NSCLC細(xì)胞的增長[10]。以上臨床和基礎(chǔ)研究為扶正抗癌方阻抑吉非替尼耐藥的潛在機(jī)制提供了一定的依據(jù)。有研究表明，Bcl-2家族是腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[11]。因此，本研究以Bcl-2家族成員Bcl-2、Mcl-1基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)進(jìn)一步探討扶正抗癌方在肺癌細(xì)胞中的促凋亡作用及機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人NSCLC細(xì)胞株H1650來源于中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海），人NSCLC細(xì)胞株A549來源于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心細(xì)胞庫（中國廣州）。2種細(xì)胞均在37℃、加濕、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2和95%空氣環(huán)境中培養(yǎng)，使用的培養(yǎng)基為RPMI-1640，該培養(yǎng)基含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清（FBS）和0.5%青—鏈霉素雙抗。

1.2 藥物及制備 扶正抗癌方顆粒劑由廣東康美藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，組成：太子參30 g、白術(shù)15 g、黃芪30 g、白花蛇舌草30 g、龍葵30 g、石見穿30 g、山慈菇30 g、炒薏苡仁30 g、八月札30 g、蛇泡簕30 g、莪術(shù)15 g、甘草10 g。采用高效液相色譜（HPLC）法對不同批次的扶正抗癌方進(jìn)行一致性分析，采用超高壓液相色譜（UPLC）法、LTQ軌道阱質(zhì)譜法對扶正抗癌方中主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[9]。在體外實(shí)驗(yàn)中，將顆粒劑溶解在RPMI-1640培養(yǎng)基中，設(shè)最終濃度為20 mg/mL，以14 000 r/min的速度離心10 min，再將上清液以0.22μm的除菌過濾器進(jìn)行過濾，最后將加入扶正抗癌方后的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境pH值調(diào)整為7.2～7.4。

1.3 主要試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、青—鏈霉素雙抗（美國Carlsbad Life Technologies公司）；FBS（美國Gibco公司）；膜聯(lián)蛋白V—異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒（美國Louis Sigma-Aldrich公司）；Bcl-2、Mcl-1特異性單克隆抗體（美國Beverly Cell Signaling Technology公司）；ECL發(fā)光液（德國Millipore公司）。Counter Star自動細(xì)胞計(jì)數(shù)（美國Denver Inno-Alliance Biotech公司）；HPLC檢測解決方案系統(tǒng)（250 mm×4.6 mm，5μm，蘇格蘭ACE公司）；Beckman FC 500流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）；Infinite M1000 PRO多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 HPLC分析扶正抗癌方的穩(wěn)定性 采用HPLC檢測解決方案系統(tǒng)對初始批次的扶正抗癌方的一致性進(jìn)行研究。流動相由0.1%甲酸的去離子水（A）和0.1%甲酸的乙腈（B）組成。梯度洗脫方案為0～5 min時(shí)5%B，5～10 min時(shí)5%～20%B，10～15 min時(shí)20%～40%B，15～40 min時(shí)40%～95%B，40～45 min時(shí)95%～100%B。流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，注入量為10μL，反應(yīng)柱的溫度維持在30℃。

1.4.2 流式細(xì)胞技術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況 按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。簡要步驟：將NSCLC細(xì)胞株（A549、H1650）接種到六孔板上，經(jīng)過24 h的培養(yǎng)后，向六孔板中加入遞增劑量（0、0.5、1.0、1.5 mg/mL）的扶正抗癌方繼續(xù)在37℃的環(huán)境下培養(yǎng)24 h。然后收集細(xì)胞，以1 500 r/min的速度離心5 min，再加入1×的binding buffer進(jìn)行重懸并轉(zhuǎn)移到流式管中，最后加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI，混合均勻后室溫放置15 min，待反應(yīng)完全后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。

1.4.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測細(xì)胞Bcl-2、Mcl-1的蛋白表達(dá) 將不同劑量（0、0.5、1.0、1.5 mg/mL）扶正抗癌方培養(yǎng)24 h后的H1650、A549細(xì)胞收集后用預(yù)冷的PBS洗滌，加入1×RIPA buffer裂解，刮取蛋白，用Thermo BCA蛋白分析試劑盒檢測蛋白濃度。將等量的蛋白溶解于5×十二烷基硫酸鈉（SDS）樣品緩沖液中，經(jīng)8%～10%SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。50 g/L脫脂奶粉（以TBST溶解）封閉后，分別加入一抗Bcl-2、Mcl-1抗體在4℃環(huán)境下孵育過夜。次日用TBST洗膜3次后，用二抗兔抗IgG孵育1 h，再洗膜3次。隨后用現(xiàn)配的ECL發(fā)光液浸潤PVDF膜后在Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下掃描，所得結(jié)果用Imagine J軟件進(jìn)行測量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)計(jì)評價(jià)采用t檢驗(yàn)，當(dāng)只有2組（雙側(cè)）時(shí)和組間差異評估采用單向方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同批次扶正抗癌方HPLC色譜圖 采用HPLC對不同批次扶正抗癌方的主要成分進(jìn)行了鑒別。圖1結(jié)果顯示，4種批次扶正抗癌方溶液的HPLC色譜圖案相似，表明扶正抗癌方具有良好的穩(wěn)定性。

圖1 不同批次扶正抗癌方HPLC色譜圖Figure 1 HPLC result for different batches of Supporting Healthy Qiand Anti-cancer Recipe

2.2 扶正抗癌方誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡 應(yīng)用0、0.5、1.0、1.5 mg/mL扶正抗癌方處理NSCLC細(xì)胞株H1650、A549并培養(yǎng)24 h后，采用流式細(xì)胞技術(shù)觀察對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果如圖2、3中象限A02、A04所示，扶正抗癌方促H1650、A549細(xì)胞凋亡作用呈顯著的劑量依賴性（1.5 mg/mL扶正抗癌方處理組差異超過50%）。圖2-B、3-B顯示，藥物處理24 h后，扶正抗癌方誘導(dǎo)組（0.5、1.0、1.5 mg/mL）凋亡率明顯高于未處理對照組（0 mg/mL）。

2.3 Bcl-2家族參與了扶正抗癌方誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡 為進(jìn)一步闡明扶正抗癌方誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究檢測了Bcl-2家族成員的2種抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1在扶正抗癌方處理的H1650和A549細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。圖4、5結(jié)果表明，在扶正抗癌方處理的H1650和A549細(xì)胞中，Bcl-2、Mcl-1的蛋白表達(dá)水平均呈劑量依賴性下降。

圖2 扶正抗癌方誘導(dǎo)H1650細(xì)胞凋亡結(jié)果Figure 2 The results of Supporting Healthy Qiand Anti-cancer Recipe inducing the apoptosis of H1650 cells

圖3 扶正抗癌方誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡結(jié)果Figure 3 The results of Supporting Healthy Qiand Anti-cancer Recipe inducing the apoptosis of A549 cells

圖5 扶正抗癌方處理的H1650、A549細(xì)胞Mcl-1的蛋白表達(dá)Figure 5 The protein expression level of Mcl-1 in H1650 and A549 cells treated with different dosages of Supporting Healthy Qiand Anti-cancer Recipe

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，肺癌屬于“肺積”“肺癰”“息積”“息賁”等范疇。肺癌病因病機(jī)尚未統(tǒng)一，但綜合多家之說認(rèn)為肺癌是本虛標(biāo)實(shí)，因虛而致實(shí)，全身屬虛、局部屬實(shí)的疾病。因正氣虛損、陰陽失調(diào)，邪毒（煙毒、穢濁之氣）乘虛入肺，邪滯于肺，導(dǎo)致肺臟功能失調(diào)，肺氣膹郁，宣降失司，氣機(jī)不利，血行受阻，津液失于輸布，津聚為痰，痰凝氣滯，瘀阻絡(luò)脈，使痰瘀毒互結(jié)，日久形成肺部積塊。吳萬垠教授根據(jù)肺癌的證型分布，采用“辨證+辨病”的中醫(yī)治療腫瘤原則，創(chuàng)制扶正抗癌方。扶正抗癌方以四君子湯為基礎(chǔ)方。方中太子參補(bǔ)氣養(yǎng)陰生津，黃芪補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表，白術(shù)健脾燥濕化痰，炒薏苡仁健脾滲濕，甘草益氣補(bǔ)中、調(diào)和諸藥，五藥同用有健脾益氣補(bǔ)肺化痰之效。山慈菇清熱解毒、消癰散結(jié)，白花蛇舌草、龍葵清熱解毒，石見穿活血化瘀、清熱散結(jié)，八月札活血理氣，蛇泡簕清熱散瘀，莪術(shù)破血行氣消積。組方從整體觀念出發(fā)，辨證與辨病相結(jié)合。扶正則重視補(bǔ)益肺脾之氣，祛邪則以清熱解毒、祛瘀散結(jié)抑瘤為主，上藥合用共奏扶正抗癌之功[12-13]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方可通過激活Caspase-3、Bax誘導(dǎo)H1650細(xì)胞的凋亡。為此我們考慮扶正抗癌方是否能夠通過其他通路對肺癌細(xì)胞凋亡起作用。本研究旨在揭示扶正抗癌方對肺癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，扶正抗癌方可能通過誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。

目前，細(xì)胞凋亡有2種被廣泛接受的經(jīng)典途徑：線粒體途徑和死亡受體途徑[14-15]。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用，它調(diào)控并參與腫瘤細(xì)胞凋亡的全過程[16]。線粒體外膜的通透性主要受到Bcl-2蛋白家族的調(diào)控。Bcl-2是線蟲凋亡分子Ced-9在哺乳細(xì)胞中的同源物，家族成員大多定位在線粒體外膜上，或受信號刺激后轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上。根據(jù)既往研究可知，Bcl-2蛋白家族中的促凋亡因子Bax能沿細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體外膜，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體膜的通透性。因此，當(dāng)Bax水平升高而跨膜電壓下降時(shí)，位于線粒體中的蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素可被釋放，從而引起一系列反應(yīng)，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生細(xì)胞凋亡[17-19]。另一項(xiàng)研究[20]表明，一種強(qiáng)心類固醇藥物bufalin可降低幾種不同類型的癌癥中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)和生存，并提高促凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表達(dá)率。這些研究結(jié)果表明Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。與此一致，我們研究發(fā)現(xiàn)，扶正抗癌方可抑制Bcl-2家族中抗凋亡基因Bcl-2、Mcl-1的蛋白表達(dá)。

綜上所述，扶正抗癌方誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，其可通過調(diào)控Bcl-2家族促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮其治療肺癌的作用。本結(jié)果進(jìn)一步揭示了扶正抗癌方作為腫瘤抑制化合物抑制肺癌細(xì)胞生長的新機(jī)制。